مقايسة مبيد للجراثيم في الدم للنشاط المبيد للجراثيم بوساطة الأجسام المضادة بوساطة تكميلية

Abstract

المصدر: Weerts ، H. P. ، et al. مقايسة مبيد للجراثيم خاصة بالشيغيلا عالية الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتقييم نشاط مبيد للجراثيم بوساطة تكميلية للأجسام المضادة الموجودة في المصل. يجمع هذا النهج بين المصل المعزول والبكتيريا المسببة للأمراض والبروتينات التكميلية الخارجية. عند الحضانة ، تزرع البكتيريا على صفيحة أجار ، ويتم قياس المستعمرات المنتجة لقياس عيار مبيد للجراثيم في الدم.

Protocol

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير البكتيريا التكميلية والاستهداف

1. تحضير مكمل الأرانب الصغيرة (BRC)
   ملاحظة: يمكن العثور على المعايير التفصيلية لاختيار الدفعة التكميلية هنا: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
   1. احصل على BRC المجمدة وقم بإذابة الثلج بالماء البارد الجاري. امزج BRC فعليا كل ~ 10-20 دقيقة حتى يذوب تماما. لا تعرض BRC لدورات التجميد والذوبان المتكررة.
   2. أثناء ذوبان BRC ، قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل أو 5 مل أو 15 مل. ضع الأنابيب المصنفة على الثلج لتبرد مسبقا. Aliquot الحجم المناسب BRC إلى أنابيب الطرد المركزي المبردة مسبقا (بعد الملء ، أعد كل أنبوب على الفور إلى الجليد). قم بتخزين الكميات عند ≤ -70 درجة مئوية في الفريزر.
      ملاحظه: هناك حاجة إلى ما يقرب من 1 مل من المكمل لكل لوحة فحص. الحصص التكميلية للاستخدام الفردي ويجب اقتباسها في مجلدات مناسبة لتخطيطات الفحص.
   3. لتحضير BRC معطل بالحرارة ، قم بإذابة جزء واحد من BRC النشط. قم بإعداد حمام مائي 56 درجة مئوية. بعد إذابة BRC تماما ، انقله إلى الحمام المائي واحتضنه لمدة 30 دقيقة.
   4. بعد الحضانة ، قم بإزالة BRC المعطلة بالحرارة من الحمام المائي واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-15 دقيقة. قم بتخزين الكميات عند ≤ -10 درجة مئوية.
2. تحضير مخزون البكتيريا المستهدفة
   ملاحظة: يستخدم الإجراء أدناه لإعداد 48 حصة من مخزون البكتيريا المستهدفة. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الحصص ، فيمكن توسيع نطاق البروتوكول.
   1. قم بإزالة قارورة مخزون البكتيريا الرئيسية من الفريزر واكشط سطح البكتيريا المجمد لإزالة كمية صغيرة من الثلج من القارورة على صفيحة أجار الدم. أعد قارورة المخزون الرئيسية على الفور إلى الفريزر.
   2. ضع هذا المخزون البكتيري الصغير على صفيحة أجار الدم وقم بتغطيته بغطاء اللوحة. احتضن اللوحة رأسا على عقب طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ CO₂.
   3. انقل ~ 10 مستعمرات ناعمة معزولة إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من مرق LB. احتضن لمدة 3-5 ساعات عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف حتى يحتوي مرق الثقافة على OD₆₀₀ من ~ 0.6-0.7.
   4. احصد أعلى 12.5 مل من المزرعة وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي للثقافة عند 15,000 × جم لمدة دقيقتين باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 25 مل من الجلسرين المعقم 15٪.
   5. تخلط جيدا وتحف 0.5 مل من الحصص في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 مل (~ 48 أنبوبا). قم بتخزين الكميات في ≤ -70 درجة مئوية في الفريزر.
   6. تأكد من الهوية البكتيرية باستخدام اختبار التراص قبل الاستخدام.
3. تحديد عامل التخفيف الأمثل لمخزون البكتيريا المستهدفة
   ملاحظة: يجب معايرة كل دفعة من مخزون البكتيريا المستهدفة في ظروف الفحص لتحديد التخفيف اللازم لإنتاج ~ 120 CFU / بقعة على ألواح LB.
   1. احصل على لوحة ميكروتيتر (لوحة التخفيف) وأضف 135 ميكرولتر من محلول الفحص إلى البئر 1A. أضف 120 ميكرولتر من زبدة الفحص إلى الآبار 1B-1H.
   2. قم بإزالة قارورة من البكتيريا المستهدفة المجمدة من الفريزر وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. أضف 15 لتر من المرق البكتيري المذاب إلى البئر 1A لتخفيف المخزون البكتيري بمقدار 10 أضعاف.
   3. انقل 30 ميكرولتر من المحلول البكتيري من البئر 1A إلى البئر 1B لإجراء تخفيف تسلسلي 5 أضعاف. استمر في التخفيفات التسلسلية 5 أضعاف إلى البئر 1H ليصبح المجموع 8 تخفيفات (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1: 31 250; 1: 156 250; 1:781 250).
   4. احصل على لوحة ميكروتيتر أخرى (لوحة الفحص) وأضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى جميع الآبار في العمودين 1 و 2 في لوحة الفحص.
   5. انقل 10 ميكرولتر من البكتيريا المخففة من كل بئر في العمود 1 من لوحة التخفيف إلى الآبار المقابلة في العمودين 1 و 2 من لوحة الفحص. يتم نقل 10 ميكرولتر من البكتيريا من البئر 1A من لوحة التخفيف إلى البئر 1A و 2A في لوحة الفحص ، إلخ.
   6. استمر في الاختبار كما هو موضح في مقايسة مبيد الجراثيم في المصل (SBA) أدناه للتحكم أ والتحكم ب ، الخطوتين 3.6-3.12.
   7. بعد تحضين الصفائح على الجليد، استخدم ماصة متعددة القنوات مع 8 أطراف ماصة لاكتشاف 10 ميكرولتر من الآبار الموجودة في العمود 1 على صفيحة LBA. أيضا ، حدد الآبار من العمود 2 على لوحة LBA.
   8. تابع الاختبار كما هو موضح أدناه في الخطوات 3.14-4.6.
   9. تحديد تخفيف البكتيريا الذي ينتج ~ 120 CFU / بقعة في Control B ، سيتم استخدام هذا التخفيف في الفحص.

< p class = "jove_title" >2. فحص مبيد الجراثيم في الدم (SBA)

ملاحظة: الإجراء الموضح أدناه مخصص للوحة فحص واحدة ، ولكن يمكن زيادة عدد لوحات الفحص.

1. عينات اختبار تعطيل الحرارة عن طريق احتضان العينات في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة < br / > ملاحظه: يجب تعطيل عينات الاختبار بالحرارة قبل الاختبار لإلغاء أي نشاط تكميلي داخلي. يمكن القيام بذلك قبل الفحص ويمكن إعادة تجميد العينات المعطلة أو تخزينها عند 4 درجات مئوية حتى يتم اختبارها.
2. احصل على لوحة الفحص وأضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى الأعمدة من 1 إلى 12 من الصفوف من A إلى G. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص إلى العمودين 1 و 2 من الصف H ، انظر الجدول 1.
3. قم بتحميل 30 ميكرولتر من كل عينة اختبار، في نسختين، إلى الصف H من لوحة الفحص. على سبيل المثال ، قم بتوزيع 30 ميكرولتر من العينة 1 في الآبار 3H و 4H ، وقم بتوزيع 30 ميكرولتر من العينة 2 في الآبار 5H و 6H ، إلخ.
4. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 3 أضعاف لعينات الاختبار باستخدام ماصة متعددة القنوات.​
   1. قم بإزالة 10 μ من العينة من الآبار 3H-12H ونقلها إلى الآبار المقابلة في الصف G واخلط العينة جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 8-10 مرات.
   2. ثم قم بإزالة 10 μ من الآبار 3G-12G ونقلها إلى الآبار المقابلة في الصف F واخلطها جيدا.
   3. استمر في هذه التخفيفات التسلسلية من خلال الصف أ. بعد خلط الآبار في الصف A ، قم بإزالة والتخلص من 10 ميكرولتر من الآبار 3A-12A بحيث تحتوي جميع الآبار على 20 ميكرولتر
      ملاحظه: نظرا لاستخدام 20 ميكرولتر من المصل في حجم فحص إجمالي يبلغ 80 ميكرولتر ، فهناك تخفيف إضافي بمقدار 4 أضعاف في الفحص. يجب أن يؤخذ هذا التخفيف في الاعتبار أثناء حساب عيار SBA بضرب تخفيف المصل في 4. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام تخفيف بداية 1: 2 ، فإن التخفيف الفعلي الذي يتم اختباره هو 1: 8.
5. قم بإزالة قارورة واحدة من مخزون البكتيريا المستهدفة المجمدة وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة. تمييع البكتيريا في 20 مل من المخزن المؤقت للفحص وفقا لعامل التخفيف الأمثل المحدد مسبقا (تم تحديد عامل التخفيف هذا في القسم 1.3). أضف 10 ميكرولتر من البكتيريا المخففة إلى كل بئر من لوحة الفحص باستخدام ماصة متعددة القنوات.
6. قم بإزالة قارورة واحدة من BRC المجمدة وقارورة واحدة من BRC المجمدة المعطلة بالحرارة ، أو قم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة بالماء البارد الجاري ، أو ضعها على شبكة خزانة السلامة البيولوجية مع نفخ الهواء لإذابة الجليد بسرعة.
7. قم بإعداد محلول 20٪ من BRC المعطلة بالحرارة. امزج 100 ميكرولتر من BRC المعطل بالحرارة مع 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمقايسة. أضف 50 ميكرولتر من محلول BRC المعطل بالحرارة بنسبة 20٪ إلى جميع الآبار في العمود 1 (آبار التحكم A).
   ملاحظه: يستخدم BRC المعطل بالحرارة كعنصر تحكم لمراقبة القتل غير المحدد (NSK) في الفحص.
8. قم بإعداد محلول 20٪ من BRC الأصلي. امزج 1 مل من BRC الأصلي مع 4 مل من المخزن المؤقت للمقايس. أضف 50 ميكرولتر من هذا الخليط إلى جميع الآبار في الأعمدة من 2 إلى 12 (التحكم B واختبار عينات الآبار).
   ملاحظه: التركيز النهائي ل BRC في خليط التفاعل هو 12.5٪.
9. امزج لوحة الفحص لفترة وجيزة عن طريق رجها برفق لمدة 10-15 ثانية على شاكر اللوحة أو امزجها عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 8 مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات.
10. ضع لوحة الفحص في حاضنة ميكروبيولوجية 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (بدون اهتزاز).
11. جفف 2 لوح LBA عن طريق إزالة الأغطية ووضع الألواح متجهة لأعلى في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 40-60 دقيقة.
12. عند اكتمال الحضانة لمدة ساعتين ، حرك لوحة الفحص إلى الثلج الرطب واحتضانها لمدة 10-20 دقيقة لإيقاف التفاعل.
13. باستخدام ماصة ذات 12 قناة ، امزج الآبار في الصف H ، وضعي 10 ميكرولتر من خليط التفاعل في قاع صفيحة LBA. قم بإمالة اللوحة على الفور واترك البقع تعمل لمسافة ~ 1.5-2 سم. كرر هذا الإجراء للصفوف G و F و E ، مع اكتشافها فوق الصف السابق على لوحة LBA. يتم رصد الصف E و F و G و H على لوحة LBA واحدة ويتم رصد الصفوف A و B و C و D على لوحة LBA ثانية بنفس الطريقة ، انظر الشكل 1.
14. احتضان ألواح LBA في درجة حرارة الغرفة حتى يتم امتصاص المحلول في ألواح LBA (10-15 دقيقة). ضع الأغطية على ألواح LBA وضع ألواح LBA في الحاضنة الميكروبيولوجية رأسا على عقب لتحتضانها طوال الليل (~ 16-18 ساعة). احتضان Shigella flexneri 2a و 3a عند 29 درجة مئوية واحتضان S. sonnei عند 26 درجة مئوية
    ملاحظه: تنتج درجات الحرارة هذه "مستعمرات صغيرة" أصغر بأحجام مناسبة للعد الدقيق بواسطة عداد المستعمرات9.
15. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، أضف 25 مل من تراكب أجار (عند ~ 55 درجة مئوية) تحتوي على 100 ميكروغرام / مل TTC و 0.1٪ NaN₃ لكل لوحة LBA.
16. احتضان ألواح LBA عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للبكتيريا الباقية بتكوين لون أحمر ، انظر الشكل 1 أدناه.
صور
17. لوحات باستخدام كاميرا رقمية ونقل الصور إلى جهاز كمبيوتر حيث تم تثبيت برنامج تعداد المستعمرات المتكامل (NICE) الخاص ب NIST ، انظر الشكل 2.
    ملاحظه: يتوفر برنامج عد المستعمرات NICE مجانا. راجع قائمة المواد للحصول على التفاصيل وتعليمات التثبيت.

الجدول 1: تخطيط لوحة الفحص. يحتوي العمودان 1 و 2 على آبار التحكم التكميلية. يقع Control A في العمود 1 وهو التحكم التكميلي المعطل بالحرارة ، ويحتوي على SBA buffer ، والبكتيريا ، والمكمل المعطلة بالحرارة. يقع التحكم B في العمود 2 وهو عنصر التحكم التكميلي النشط ، ويحتوي على SBA buffer ، والبكتيريا ، والمكملة. تحتوي الأعمدة 3-12 على عينات مصل. يتم تشغيل كل عينة بشكل مكرر ومخفف بشكل متسلسل 3 أضعاف من الصف H إلى الصف A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 أ التحكم أ التحكم ب التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 التخفيف 8 ب التحكم أ التحكم ب التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 التخفيف 7 ج التحكم أ التحكم ب التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 التخفيف 6 د التحكم أ التحكم ب التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 التخفيف 5 ه التحكم أ التحكم ب التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 التخفيف 4 ويف التحكم أ التحكم ب التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 التخفيف 3 ز التحكم أ التحكم ب التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 التخفيف 2 ح التحكم أ التحكم ب التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 التخفيف 1 عينة 1 عينة 2 عينة 3 عينة 4 عينة 5

Results

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: لوحات LBA بعد تطوير اللون. نمت المستعمرات الدقيقة البكتيرية الممثلة S. flexneri 3a بين عشية وضحاها إلى الحجم المناسب. تمت إضافة أجار التراكب وطورت المستعمرات لونا أحمر عن طريق تقليل مركب TTC في أجار التراكب.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: واج...

Materials