مقايسة تثبيط التخثر الدموي للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد مستضد مستهدف

الملخص

المصدر: Kaufmann، L. et al. ، اختبار تثبيط تضخم الدم (HI) المحسن لتحديد عيار الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح الفيديو مقايسة تثبيط التخثر الدموي للكشف عن الأجسام المضادة في الدم ضد مستضدات معينة. يتم تحقيق تأكيد تثبيط التخثر الدموي في بئر الاختبار والتراخيص الدموي في بئر التحكم من خلال أنماط بصرية مميزة. يلعب هذا الاختبار دورا مهما في تقييم الاستجابة المناعية وفعالية اللقاح ودراسة الالتهابات الفيروسية في علم الفيروسات والمناعة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. مجموعة المصل

1. جمع عينات المصل من البشر في نقاط الاهتمام الزمنية في هذه الدراسة ، جمعنا الأمصال في الأيام 0 (وقت التطعيم ضد الأنفلونزا) ، +7 ، +30 ، +60 ، +180 بعد التطعيم.
2. للحصول على المصل ، قم بالطرد المركزي لأنابيب العينة عند 1,200 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20 - 25 درجة مئوية).
   ملاحظه: يجب تخزين عينات الدم غير بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ولا تزيد عن 24 ساعة.
3. يقسم المصل إلى أنابيب مختلفة (قوارير بالتبريد) ويجمد عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. قم بإجراء المقايسات اللاحقة دفعة واحدة ، بما في ذلك جميع النقاط الزمنية لشخص واحد لتقليل التباين داخل المريض.

< p class = "jove_title" >2. تحضير المستضدات

< p class = "jove_content" >تنبيه: يتم استخدام خمسة مستضدات مختلفة (انظر جدول المواد). تحضير المستضدات في مختبر السلامة الحيوية المستوى 2 (BSL-2).

1. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، أعد تكوين المحتويات الإجمالية لحامبولة مستضد الأنفلونزا المجففة بالتجميد مع 1.0 مل من الماء المقطر والسماح للمستضد المذاب بالوقوف لمدة لا تقل عن 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة.
قم
2. بنقل محلول المستضد إلى أنابيب 1.5 مل وتجميدها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

< p class = "jove_title" >3. تحضير مرشح الكوليرا

ملاحظة: يستخدم ترشيح الكوليرا كنزيم مدمر للمستقبلات (RDE) وفقا لبروتوكول منظمة الصحة العالمية (WHO). هذا يزيل المثبطات الفطرية من المصل والتي من شأنها أن تتداخل مع المقايس.

1. أعد تكوين RDE المجفف بالتجميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. قم بتخزين محلول RDE في أنبوب سعة 15 مل عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.

< p class = "jove_title" >4. فحص HA

ملاحظة: للتأكد من أن فحوصات تثبيط التضخم الدموي (HI) قابلة للمقارنة بين عدة لوحات ، يجب استخدام نفس الكمية من جزيئات الفيروس لكل لوحة. يتم إجراء مقايسة التضخم الدموي (HA) (وتسمى أيضا معايرة HA) لتحديد جزيئات الفيروس اللازمة لتضخم الدم ويتم تسجيلها في وحدات HA. "وحدة" تضخم الدم هي وحدة تشغيلية تعتمد على الطريقة المستخدمة في معايرة HA وليست قياسا للكمية المطلقة من الفيروس. وبالتالي ، يتم تعريف وحدة HA على أنها كمية الفيروس اللازمة لتراص حجم متساو من معلق كرات الدم الحمراء الموحد. وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، فإن الكمية القياسية المستخدمة في اختبار HI هي 4 وحدات HA لكل 25 ميكرولتر. للحصول على توضيح لمبدأ اختبار HA ، انظر الشكل 1.

ملاحظة: تعتمد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) المستخدمة على نوع فيروس الأنفلونزا في الفحص (الجدول 1). علاوة على ذلك ، بالنسبة لأنواع مختلفة من ألواح الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا ، يختلف وقت الحضانة وكذلك ظهور الخلايا غير المتراكمة (الجدول 2).

1. تحضير تعليق كرات الدم الحمراء
   قم
   1. بتخفيف معلق مخزون كرات الدم الحمراء (10٪ ، v / v ؛ باستثناء النوع البشري O) (انظر جدول المواد) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لعمل التركيزات المناسبة لكرات الدم الحمراء للطيور والثدييات بنسبة 0.75٪ و 1٪ على التوالي.
2. تحضير صفيحة الميكروتيتر ذات 96 بئر
   ملاحظة: انظر الشكل 2 للحصول على نظرة عامة على تصميم اللوحة.    
   1. أضف 25 ميكرولتر من PBS إلى الآبار من 1 إلى 12 من كل صف مستخدم من صفيحة ميكروتيتر سعة 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل 2). استخدم لوحة الميكروتيتر على شكل حرف V عند العمل مع كرات الدم الحمراء للطيور ، مثل الدجاج والديك الرومي. استخدم صفيحة microtiter على شكل حرف U عند العمل مع كرات الدم الحمراء للثدييات ، مثل خنازير غينيا والنوع البشري O (الجدول 2).
   2. أضف 25 ميكرولتر من مستضد الأنفلونزا إلى البئر الأول من صفوف المستضد ، والتي يتم ترتيبها في نسخ مكررة. لا يتم إضافة مستضد إلى صفوف التحكم. يجب ألا تظهر صفوف التحكم تأثير التضخم الدموي وتكون بمثابة عناصر تحكم سلبية (الشكل 2).
   3. قم بإجراء تخفيف تسلسلي 2 أضعاف عن طريق نقل 25 ميكرولتر من البئر الأول لصفوف المستضد إلى الآبار المتتالية باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج كل خطوة من خطوات التخفيف عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل برفق 10 مرات.
   4. تخلص من آخر 25 ميكرولتر من الآبار الأخيرة.
   5. أضف 25 ميكرولتر من PBS إلى الآبار من 1 إلى 12 من كل صف مستخدم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، للوصول إلى الحجم الإجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل بئر.
   6. أضف 50 ميكرولتر من معلق كرات الدم الحمراء إلى كل بئر مستخدم باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   7. اضغط على الطبق بعناية 10 مرات على الجوانب الأربعة للخلط.
   8. قم بتغطية اللوحة بغطاء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة للفترة المناسبة من الوقت اعتمادا على أنواع كرات الدم الحمراء المستخدمة (انظر الجدول 2). لا تحرك اللوحة أثناء الحضانة.
3. قراءة اللوحة
   ملاحظة: تختلف القراءة قليلا عند استخدام كرات الدم الحمراء للطيور مقارنة بكرات الدم الحمراء للثدييات ، بسبب الآبار الدقيقة ذات الأشكال المختلفة (الشكل 3).
   1. قراءات كرات الدم الحمراء للطيور
      1. قم بإمالة اللوحة بزاوية 90 درجة لمدة 25 ثانية < / > ملاحظه: نقطة نهاية المعايرة بالتحليل الحجمي HA هي آخر بئر يحدث فيها تضخم الدم الكامل. يحتوي هذا البئر على 1 وحدة HA من الفيروسات. بسبب التخفيفات المزدوجة للمستضد ، فإن بئرين قبل نقطة نهاية معايرة HA هما البئر الذي يحتوي على 4 وحدات HA من الفيروس (الشكل 4).
      2. ضع علامة على النتائج على الفور ، بينما لا تزال اللوحة في وضع مائل ، على مخطط مطبوع للوحة 96 بئرا. تظهر أنماط تراص كرات الدم الحمراء للطيور في الشكل 3.
   2. قراءة كرات الدم الحمراء للثدييات
      1. ضع علامة على النتائج على مخطط مطبوع للوحة 96 بئرا ، دون إمالة اللوحة (الوضع الأفقي على المقعد).
         ملاحظه: عندما يحدث تضخم الدم ، لا تستقر الخلايا المتراكمة في القاع ، بينما تظهر الخلايا غير المتراكمة على شكل هالة في قاع البئر. هالة الخلايا المتراكمة جزئيا أقل كثافة وقطرها أكبر (الشكل 3).
   3. تحديد 4 وحدات HA .
      ملاحظه: يعد إمالة اللوحة أمرا بالغ الأهمية للتمايز بين أنماط الطيور لأن جميع الأنواع الثلاثة المختلفة من أنماط التراص (التراص بالكامل ، والمتراكمة جزئيا ، وغير المتراكمة) تظهر كزر عندما لا تكون مائلة.

< p class = "jove_title" >5. مرحبا الفحص

ملاحظة: تم تحسين سير عمل البروتوكول للسماح بمعالجة أكثر كفاءة لعينات متعددة في نفس الوقت ، باستخدام خطوط أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وجهاز تدوير حراري (انظر أدناه).

1. تحضير عينات المصل
   ملاحظه: تحضير عينات المصل في مختبر السلامة الحيوية المستوى 2 (BSL-2).
   1. قم بإذابة عينات المصل المجمدة لكل نقطة زمنية لكل شخص (انظر الخطوة 1.2) في درجة حرارة الغرفة.
   2. أضف كمية من 10 ميكرولتر من كل عينة مصل مذابة إلى أنبوب من شريط أنبوب PCR (10 أنابيب في شريط واحد).
      ملاحظه: تتمثل الميزة الكبيرة لاستخدام شرائط أنبوب PCR في أنه يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات للخطوات التالية في مقايسة HI ؛ هذا يوفر الكثير من الوقت عند اختبار عدد كبير من عينات المصل وعند إجراء مقاييس متكررة لنفس العينات لعيارات الأجسام المضادة ضد سلالات الفيروس المختلفة.
   3. قم بتخزين عينات المصل المقتبسة في شرائط أنبوب PCR عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   4. قبل يوم واحد من إجراء فحص HI ، قم بإذابة عينة المصل ذات الأهمية في درجة حرارة الغرفة.
   5. أضف 10 ميكرولتر من المصل المضاد المناسب إلى أنبوب PCR فارغ.
      ملاحظه: ليكون بمثابة عنصر تحكم إيجابي ، يجب أن يتطابق المصل المضاد ضد فيروس معين مع الفيروس المستخدم. يسمح التحكم الإيجابي بتوحيد أداء اللوحة على لوحات متعددة.
   6. أضف 30 ميكرولتر من محلول ترشيح الكوليرا إلى كل حصة مصلية وإلى مصل مضاد (3 كميات من ترشيح الكوليرا إلى حجم واحد من المصل) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
   7. احتفظ بأنابيب PCR في رف PCR سعة 96 بئر أو صندوق أطراف فارغ ودوامة لمدة 5 ثوان.
   8. احتضان العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية باستخدام جهاز التدوير الحراري.
   9. احتضان العينات عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعطيل ترشيح الكوليرا باستخدام جهاز تدوير حراري.
      ملاحظه: اعتمادا على الدراجة الحرارية ، يمكن برمجة هذه الخطوة لأتمتة العملية بشكل أكبر.
   10. احتفظ بأنابيب PCR في رف PCR سعة 96 بئر أو صندوق أطراف فارغ ودوامة لمدة 5 ثوان.
   11. قم بتخزين العينات على حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة حتى استخدامها في فحص HI.
2. مرحبا المقايسة
   ملاحظه: للحصول على توضيح لمبدأ اختبار HI ، انظر الشكل 1. اعتمادا على الفيروس ، يتم استخدام أنواع مختلفة من كرات الدم الحمراء للفحص (الجدول 1). تستخدم الأنواع المختلفة من كرات الدم الحمراء في أنواع مختلفة من الألواح المكونة من 96 بئرا ، ويختلف وقت الحضانة وكذلك مظهر الخلايا غير المتراكمة (الجدول 2). بالنسبة لمقايسة HI ، تتم إضافة 4 وحدات HA من الفيروس أو المستضد إلى سلسلة التخفيف 2 أضعاف للعينات.
   1. تحضير محلول المستضد
      1. احسب حجم محلول المستضد المطلوب وفقا لعدد الألواح المكونة من 96 بئرا المستخدمة (25 ميكرولتر من المستضد لكل بئر × 96 = 2,400 ميكرولتر من المستضد لكل لوح 96 بئرا ؛ أضف 100 ميكرولتر لكل لوح إضافي بسبب استخدام خزان للماصة متعددة القنوات ؛ إجمالي 2.5 مل من المستضد لكل لوحة).
         ملاحظه: على سبيل المثال ، إذا تم قياس 100 عينة مصل ، فستكون هناك حاجة إلى 10 أطباق (10 عينات لكل لوحة): 2.5 مل × 10 = 25 مل من محلول المستضد المطلوب في المجموع.
      2. قم بإعداد التخفيف المناسب ل 4 وحدات HA للحجم المحسوب باستخدام PBS.
         ملاحظة: يتم تحديد 4 وحدات HA لمقايسة HA. للحصول على الكمية المناسبة من المستضد ، اقسم الحجم المحسوب على العيار المقابل ل 4 وحدات HA. على سبيل المثال ، 4 وحدات HA تتوافق مع تخفيف 1/64 ، ونحتاج إلى 15,000 ميكرولتر من محلول المستضد: 15,000/64 = 234.4 ميكرولتر من مستضد الأنفلونزا المجفف بالتجميد المذاب.
   2. تحضير تعليق كرات الدم الحمراء
      1. احسب حجم تعليق كرات الدم الحمراء المطلوب وفقا لعدد ألواح الميكروتيتر ذات 96 بئرا المستخدمة (50 ميكرولتر معلق كرات الدم الحمراء لكل بئر × 96 = 4,800 ميكرولتر من معلق كرات الدم الحمراء لكل لوح 96 بئرا ؛ أضف 200 ميكرولتر لكل لوحة إضافية بسبب استخدام خزان للماصة متعددة القنوات).
      قم
      2. بتخفيف معلق مخزون كرات الدم الحمراء (عادة 10٪ ، v / v ؛ باستثناء النوع البشري O) باستخدام PBS لجعل التركيزات المناسبة لكرات الدم الحمراء للطيور والثدييات بنسبة 0.75٪ و 1٪ على التوالي.
   3. تحضير صفيحة الميكروتيتر 96 بئرا
      1. قم بتسمية ألواح الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا (معرف العينة ، والتحكم الإيجابي ، والمعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي). يرجى التحقق من اتجاه اللوحة في الشكل 5 بعناية.
      2. أضف 25 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر باستثناء البئر الأول من صف "المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي" (الشكل 5، الصف 12) باستخدام الماصة متعددة القنوات.
         ملاحظه: تم إجراء معايرة التحليل بالتحليل الحجمي الخلفي للتحقق مما إذا كان تخفيف المستضد المستخدم يساوي 4 وحدات HA. يشار إلى عيار مستضد مكون من 4 وحدات HA إذا حدث تضخم الدم في الآبار الثلاثة الأولى من صف "المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي" ، ولكن ليس في البئر الرابع.
      3. أضف 50 ميكرولتر من محلول المستضد المحضر (الموصوف في 5.2.1) إلى البئر الأول من صف "المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي" (الصف 12).
      4. أضف 25 ميكرولتر من عينات المصل المعالجة ب RDE إلى الآبار الأولى من الصفوف من 1 إلى 10 على كل لوحة، باستخدام الماصة متعددة القنوات.
      5. أضف 25 ميكرولتر من المصل المضاد المناسب إلى البئر الأول من الصف الحادي عشر كعنصر تحكم إيجابي.
      6. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية ثنائية الطي عن طريق نقل 25 ميكرولتر من البئر الأول لكل صف (1 - 12) إلى آبار متتالية باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10-15 مرة لكل خطوة تخفيف. يمكن استخدام نفس النصائح لكل خطوة تخفيف لكل عينة.
      7. تخلص من آخر 25 ميكرولتر من الآبار الأخيرة.
      8. أضف 25 ميكرولتر من محلول المستضد باستخدام ماصة متعددة القنوات إلى كل بئر من الصفوف من 1 إلى 11 (عينات مصل الدم ومضاد للمصل). يمكن استخدام نفس النصائح إذا لم تلمس الآبار.
      9. أضف 25 ميكرولتر من PBS بدلا من المستضد إلى كل بئر من صف "المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي" (الصف 12).
      10. اضغط على الطبق بعناية 10 مرات على الجوانب الأربعة للخلط.
      11. غطي الطبق بغطاء واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لا تحرك اللوحة أثناء الحضانة.
      12. أضف 50 ميكرولتر من تعليق كرات الدم الحمراء إلى كل بئر.
      13. اضغط على الطبق بعناية 10 مرات على جميع الجوانب الأربعة للخلط.
      14. قم بتغطية اللوحة بغطاء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة للفترة المناسبة من الوقت اعتمادا على أنواع كرات الدم الحمراء المستخدمة (انظر الجدول 2). لا تحرك اللوحة أثناء الحضانة.
   4. قراءة اللوحة
      ملاحظه: عيار HI هو مقلوب التخفيف الأخير للمصل (المضاد) الذي يمنع تماما تضخم الدم. من المهم مراعاة أن الأمصال المعالجة ب RDE قد تم تخفيفها بالفعل بنسبة 1: 4 وبعد خطوة التخفيف التسلسلي ، يتم تخفيف الأمصال في الآبار الأولى بنسبة 1: 8 ، وهو ما يتوافق مع عيار HI من 8.
      1. قراءات كرات الدم الحمراء للطيور
         1. قم بإمالة اللوحة بزاوية 90 درجة لمدة 25 ثانية
            ملاحظه: يعد إمالة اللوحة أمرا بالغ الأهمية للتمايز بين أنماط الطيور لأن جميع الأنواع الثلاثة المختلفة من أنماط التراص (التراص بالكامل ، والمتراكمة جزئيا ، وغير المتراكمة) تظهر كزر عندما لا تكون مائلة.
         2. ضع علامة على النتائج على الفور ، بينما لا تزال اللوحة في وضع مائل ، على مخطط مطبوع للوحة 96 بئرا. تظهر أنماط تراص كرات الدم الحمراء للطيور في الشكل 3.

الجدول 1: مستضدات الأنفلونزا والأنواع المقابلة من كرات الدم الحمراء. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (NIBSC).

مستضد الأنفلونزا أ/كاليفورنيا/7/09 (H1N1) A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) A/Texas/50/2012 (H3N2) ب / بريسبان / 60/08 ب / ماساتشوستس / 02/2012 أنواع كرات الدم الحمراء دجاجة خنزير غينيا خنزير غينيا تركيا تركيا

الجدول 2: ظروف الفحص مع أنواع مختلفة من كرات الدم الحمراء.وفقا لبروتوكول منظمة الصحة العالمية. (* يتدفق عند الإمالة).

أنواع كرات الدم الحمراء دجاجة تركيا خنزير غينيا النوع البشري O تركيز كرات الدم الحمراء (حجم / حجم) 0.75٪ 0.75٪ 1٪ 1٪ نوع لوحة ميكروتيتر قاع V قاع V قاع U قاع U وقت الحضانة ، RT 30 دقيقة 30 دقيقة 1 ساعة 1 ساعة ظهور الخلايا غير المتراكمة زر* زر* هالو هالو

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مبدأ تضخم الدم وتثبيط التخثر الدموي.لا يحدث أي تضخم الدم في حالة التحكم السلبي بدون فيروسات وأجسام مضادة (العمود الأيسر) ، وكريات الدم الحمراء تضخم الدم فقط في وجود فيروس الأنفلونزا (العمود الأوسط). ومع ذلك ، عندما يتم حظر الهيماجلوتينين لفيروس الأنفلونزا بواسطة الأجسام المضادة الخاصة بالفيروسات ، فلا يمكن أن يحدث تضخم الدم (العمود الأيمن).

< p class = "jove_content" fo: k...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 25 مل خزانات ماصات متعددة القنوات يمكن التخلص منها إنتجرا 4312 أنابيب PCR 8 آبار العلامة التجارية GMBH 781332 لحصة المصل صفيحة ميكروتيتر 96 بئر ، على شكل حرف U برنامج النقاط التجارية 92097 لمقايسة HI عند استخدام كرات الدم الحمراء للثدييات صفيحة ميكروتيتر 96 بئر ، على شكل حرف V كورنينج كوستار 3897 لمقايسة HI عند استخدام كرات الدم الحمراء للطيور أكوا إعلان iniect. تعقيم Bichsel AG 1000004 لتحضير مستضد الأنفلونزا ومحاليل ترشيح الكوليرا دجاج RBC (10٪) سيدارلين CLC8800 10٪ تعليق خلايا الدم الحمراء للدجاج في محلول Alsever ترشيح الكوليرا سيجما ألدريتش [ك8772] تستخدم كإنزيم مدمر للمستقبلات (RDE) برنامج تلفزيون Dulbecco سيجما ألدريتش د8537 لتخفيف عينات المصل وكرات الدم الحمراء والمستضدات ماصة Eppendorf متعددة القنوات، 12 قناة، 10-100 ميكرولتر سيجما ألدريتش Z683949 ماصة Eppendorf متعددة القنوات ، 8 قنوات ، 10-100 ميكرولتر سيجما ألدريتش Z683930 خنزير غينيا RBC (10٪) سيدارلين CLC1800 تعليق 10٪ من خلايا الدم الحمراء لخنزير غينيا في محلول Alsever مصل الأنفلونزا المضاد للأنفلونزا / كاليفورنيا / 7/09 HA NIBSC 14/134 تستخدم كتحكم إيجابي في اختبار HI مصل HA المضاد للإنفلونزا / سويسرا / 9715293/2013 NIBSC 14/272 تستخدم كتحكم إيجابي في اختبار HI مصل الأنفلونزا المضاد للأنفلونزا / تكساس / 50/2012 مثل HA NIBSC 13/178 تستخدم كتحكم إيجابي في اختبار HI الأنفلونزا المضادة ب / بريسبان / 60/2008 - HA المصل NIBSC 13/254 تستخدم كتحكم إيجابي في اختبار HI مصل الأنفلونزا المضادة ل B / ماساتشوستس / 02/2012 HA NIBSC 13/182 تستخدم كتحكم إيجابي في اختبار HI مستضد الأنفلونزا A/California/7/09 (H1N1) (NYMC-X181) NIBSC 12/168 فيروس A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) المعطل المنقى جزئيا (حوالي 46 ميكروغرام في الساعة/مل) مستضد الأنفلونزا A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) NIBSC 14/254 فيروس A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) المعطل المنقى جزئيا (حوالي 55 ميكروغرام في الساعة/مل) مستضد الأنفلونزا A/Texas/50/2012 (H3N2) (NYMCX-223) NIBSC 13/112 م فيروس A/Texas/50/2012 (H3N2) (NYMCX-223) المعطل والنقي جزئيا (حوالي 74 ميكروغرام في الساعة/مل) مستضد الأنفلونزا B/Brisbane/60/2008 NIBSC 13/234 م فيروس B/Brisbane/60/2008 المعطل المنقى جزئيا (حوالي 42 ميكروغرام في السنة/مل) مستضد الأنفلونزا ب / ماساتشوستس / 02/2012 NIBSC 13/134 فيروس B / Massachusetts / 02/2012 المعطل والمنقى جزئيا (حوالي 35 ميكروغرام / مل) أنابيب المصل إس مونوفيت ، ساردستدت 01.1601.100 لاستخراج المصل باستخدام منشط التخثر تركيا RBC (10٪) سيدارلين CLC1180 10٪ تعليق خلايا الدم الحمراء الديك الرومي في محلول Alsever محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) جيبكو