مقالة منهجية

التحفيز في المختبر وتصور مصائد البلاعم خارج الخلية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Zhang ، Y. ، et al. التحفيز في المختبر وتصور إطلاق المصيدة خارج الخلية في البلاعم البشرية المتمايزة المشتقة من الخلايا الأحادية. J. Vis. إكسب. (2019).

يوضح هذا الفيديو التحفيز المختبري لمصائد البلاعم خارج الخلية (METs) في البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة باستخدام محفزات التهابية مختلفة مثل TNF-alpha و PMA و HOCL. يوضح الفيديو أيضا طريقة تلطيخ صبغة SYTOX ل METs للتصور.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استقطاب HMDM

  1. في ظل ظروف معقمة ، قم بإعداد وسائط التحضير M1 عن طريق إضافة γ الإنترفيرون (IFNγ ؛ 20 نانوغرام / مل) وعديد السكاريد الدهني (LPS ؛ 1 ميكروغرام / مل) إلى وسائط الاستزراع الكاملة RPMI-1640. قم بإعداد وسائط فتيلة M2 عن طريق إضافة إنترلوكين 4 (IL-4 ؛ 20 نانوغرام / مل) إلى وسائط الاستزراع RPMI-1640 الكاملة.
  2. في ظل الظروف المعقمة ، استنشق الوسائط من آبار لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية ، HMDM ، والتي تم زرعها وزراعتها كما هو موضح في القسم 1.
  3. اغسل الآبار التي تحتوي على الخلايا بعناية 3x باستخدام PBS معقم (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية) ، باستخدام 1 مل من PBS.
  4. أضف 1 مل من وسائط التحضير M1 أو M2 إلى كل بئر يحتوي على HMDM (أيهما مناسب للتجربة).
  5. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة الخلية.

2. تحفيز HMDM للحث على إطلاق MET

  1. في ظل ظروف معقمة ، قم بإعداد وسائط الثقافة التي تحتوي على محفزات مختلفة من مصائد البلاعم خارج الخلية إطلاق MET (أيهما مناسب للتجربة) إلى وسائط RPMI-1640 الكاملة: PMA (25 نانومتر) ، TNFα المؤتلف البشري (25 نانوغرام / مل) ، أو IL-8 المؤتلف البشري (50 نانوغرام / مل).
  2. للتجارب على حمض هيبوكلوروس ، تحفيز HOCl ، قم بإعداد HOCl (200 ميكرومتر) في HBSS (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية) ، مباشرة قبل إضافته إلى الخلايا. تأكد من عدم تحضير HOCl في وسائط خلوية كاملة.
    ملاحظه: يتم قياس تركيز محلول مخزون HOCl عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للمحلول عند 292 نانومتر ودرجة الحموضة = 116 واستخدام معامل انقراض 350 م -1سم -1.
  3. بعد علاج الاستقطاب الموصوف في القسم 2 ، قم بشفط وسائط الخلية من كل بئر واغسل الخلايا بعناية 3x مع 1 مل من الحصص إما: PBS المعقم (ل PMA و TNFα و IL-8) أو HBSS (ل HOCl) ، والتي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  4. للتجارب مع PMA أو TNFα أو IL-8: أضف 1 مل من الوسائط الكاملة التي تحتوي على PMA أو TNFα أو IL-8 بعد إزالة PBS في خطوة الغسيل النهائية.
  5. للتجارب على TNFα ، احتضان الخلايا لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 في حاضنة الخلية. للتجارب مع PMA و IL-8 ، احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 في حاضنة الخلية.
  6. لإجراء تجارب على HOCl ، أضف 1 مل من HOCl في HBSS بعد إزالة HBSS في خطوة الغسيل النهائية. بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة الخلية.
      قم
    1. بشفط المادة الطافية للخلية بعناية واغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 1 مل من حصة HBSS كما هو موضح في الخطوة 2.3.
    2. بعد إزالة HBSS من خطوة الغسيل النهائية ، أضف 1 مل من وسائط الثقافة RPMI-1640 الكاملة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة الخلية.

3. تصور MET في ثقافة الخلايا الحية

  1. تحضير صبغة SYTOX الخضراء في HBSS بتركيز 40 ميكرومتر.
  2. في نهاية العلاجات الموضحة في القسم 2 للحث على إطلاق MET ، أضف مباشرة 25 ميكرولتر من 40 ميكرومتر من الصبغة إلى كل بئر يحتوي على HMDM.
  3. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق في الظلام.
  4. ضع HMDM في آبار زراعة الأنسجة على مرحلة المجهر المجهر الفلوري المقلوب للتصوير.
  5. إجراءات المجهر
    1. قم بتشغيل مصدر ضوء فلورسنت واسع الطيف ومصدر ضوء المجال الساطع ومجهر مقلوب مثبت بكاميرا رقمية ملونة عالية الدقة (انظر جدول المواد).
    2. قم بتدوير عجلة المرشح إلى الموضع "رقم 2" للتألق الأخضر (الإثارة = 504 نانومتر ، الانبعاث = 523 نانومتر) لتصوير العينات الملطخة باللون الأخضر الموجودة في آبار زراعة الأنسجة.
    3. باستخدام هدف 5x ، قم بتركيز الصورة مع التركيز الخشن ، ثم مقابض التركيز الدقيقة على المجهر ، حتى تظهر الصورة حادة وواضحة ومركزة عند عرضها من خلال عدسة المجهر.
    4. قم بتبديل المجهر إلى وضع الكاميرا.
    5. ابدأ تشغيل البرنامج المقترن.
    6. حدد علامة التبويب الالتقاط في البرنامج.
    7. انقر على تشغيل زر لمعاينة الصورة وضبط مقبض التركيز الدقيق على المجهر حتى تظهر الصورة واضحة وواضحة ومركزة في نافذة معاينة البرنامج.
    8. انقر فوق الزر "الالتقاط".
      ملاحظه: سيتم عرض الصورة الملتقطة تلقائيا في البرنامج المصاحب.
    9. داخل البرنامج، انقر فوق ملف | احفظ كنوع ملف الصورة المطلوب.
    10. على المجهر ، قم بتدوير عجلة المرشح إلى الموضع "رقم 5" لتصوير المجال الساطع وكرر الخطوات 3.5.2-3.5.9 للحصول على صورة المجال الساطع المقابلة.
    11. كرر الخطوات 3.5.2–3.5.10 حسب الضرورة للحصول على الصورة لاحقا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 120Q مصدر ضوء الفلورسنت واسع الطيف EXFO حلول الضوئية ، تورنتو ، كندا سلسلة X-Cite لوحة الآبار المتعددة Corning CellBIND (12 بئر) سيجما ألدريتش CLS3336 لزراعة الخلايا حمض هيبوكلوروس (HOCl) سيجما ألدريتش 320331 لتحفيز MET إنترفيرون جاما ثيرمو فيشر PMC4031 لتحضير M1 إنترلوكين 4 العلوم المتكاملة ريل -4 لفتيلة M2 إنترلوكين 8 ميلتينيل بيوتيك 130-093-943 لتحفيز MET ل-جلوتامين سيجما ألدريتش 59202ج أضيف إلى الإعلام الثقافي أوليمبوس IX71 مجهر مقلوب أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان فوربول 12- ميريستات 13-أسيتات (PMA) سيجما ألدريتش ص 8139 لتحفيز MET محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سيجما ألدريتش د5652 لخطوات الغسيل وسائط RPMI-1640 سيجما ألدريتش R8758 لزراعة الخلايا SYTOX الأخضر تقنيات الحياة S7020 لرؤية MET TH4-200 مصدر ضوء المجال الساطع أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان سلسلة X-Cite عامل نخر الورم ألفا لونزا 300-01 أ-50 لتحفيز MET

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MET SYTOX Green TNF alpha PMA

مقالات ذات صلة