اختبار السمية الخلوية بوساطة البروتين البكتيري خارج الخلية على PMNs

الملخص

المصدر: Dankoff ، J. G. ، et al. قياس السمية الخلوية للمكورات العنقودية الذهبية ضد الكريات البيض البشرية متعددة الأشكال. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو فحصا للتحقيق في السمية الخلوية للبروتينات التي تنتجها المكورات العنقودية الذهبية ، وهي بكتيريا مسببة للأمراض ، على كريات البيض البشرية متعددة الأشكال النووية المعزولة (PMNs). تشكل البروتينات السامة للخلايا المفرزة مساما على غشاء خلية PMN ، مما يؤدي إلى موت الخلايا. عند تلطيخ الخلايا الميتة باستخدام يوديد البروبيديوم ، يتم إجراء قياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا الميتة وتقييم السمية الخلوية للبكتيريا.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تنقية الكريات البيض متعددة الأشكال البشرية وعزل المصل البشري

ملاحظة: يجب فحص جميع الكواشف بشكل روتيني بحثا عن وجود السموم الداخلية باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن السموم الداخلية المتوفرة تجاريا ويجب أن تحتوي على <25.0 بيكوغرام / مل من السموم الداخلية لمنع التحضير غير المرغوب فيه ل PMNs.

1. أحضر 50 مل من 3٪ ديكستران -0.9٪ كلوريد الصوديوم (وزن / حجم) ، 35 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم (وزن / حجم) ، 20 مل من 1.8٪ كلوريد الصوديوم (وزن / حجم) ، 12 مل من محلول التدرج بكثافة 1.077 جم / مل ، و 20 مل من الماء من درجة الحقن أو الري إلى درجة حرارة الغرفة.
2. لعزل المصل البشري ، احتضان 4 مل من دم الإنسان المسحوب حديثا بدون مضاد للتخثر عند 37 درجة مئوية في أنبوب زجاجي سعة 15 مل لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 2,000-3,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل طبقة المصل العلوية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 15 مل وضعه على الثلج.
3. اجمع بين 25 مل من دم الإنسان الكامل المسحوب حديثا (1000 وحدة / مل) مع 25 مل من درجة حرارة الغرفة 3٪ ديكستران -0.9٪ كلوريد الصوديوم (نسبة 1: 1) في أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل (الحجم الإجمالي 50 مل لكل أنبوب). امزج عن طريق هز كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل برفق ثم اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، ستظهر طبقتان منفصلتان. انقل الطبقة العليا من كل خليط دم ديكستران إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي بحجم 450 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع فرامل منخفضة أو بدونها.
5. استنشق كل من المواد الطافية بعناية وتخلص منها دون إزعاج كريات الخلية. أعد تعليق كل حبيبات خلية برفق في 2 مل من درجة حرارة الغرفة 0.9٪ كلوريد الصوديوم, اجمع الكريات المعلقة في أنبوب مخروطي واحد 50 مل, ثم أضف المتبقي 0.9٪ كلوريد الصوديوم (الحجم النهائي 35 مل).
6. قم بوضع 10 مل من درجة حرارة الغرفة بعناية بمحلول تدرج بكثافة 1.077 جم/مل أسفل تعليق الخلية باستخدام ماصة يدوية. تدور عند 450 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع فرامل منخفضة أو بدونها. استنشق المادة الطافية برفق دون إزعاج حبيبات الخلية. سيحتوي المادة الطافية على خلايا أحادية النواة أحادية الدم المحيطية التي يمكن جمعها كما هو موضح سابقا.
7. قم بتحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من الماء بدرجة حرارة الغرفة. امزج برفق عن طريق هز الأنبوب لمدة 30 ثانية. سيكون تحلل خلايا الدم الحمراء مصحوبا بانخفاض واضح في التعكر.
8. أضف على الفور 20 مل من 1.8٪ كلوريد الصوديوم (في درجة حرارة الغرفة [RT]) وعينة أجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: من المهم تقليل الوقت الذي تترك فيه PMNs في الماء بمفرده بعد تحلل خلايا الدم الحمراء لزيادة إنتاجية PMN ومنع تحلل و / أو تنشيط PMN.
9. شفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 2 مل من وسط RT RPMI 1640 وضعها على الثلج.
10. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. أعد تعليق PMNs المنقاة بتركيز 1 × 10⁷ خلايا / مل مع RPMI المثلج واحتفظ بها على الجليد.
11. اجمع بين 100 ميكرولتر من PMNs المنقاة (1 × 10⁶ خلايا) مع 300 ميكرولتر من محلول ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات (DPBS) المثلج البارد الذي يحتوي على 1 ميكرولتر من صبغة يوديد البروبيديوم في أنبوبين لقياس التدفق الخلوي. للتحكم الإيجابي في تلف غشاء البلازما ، أضف 40 ميكرولتر من محلول Triton X-100 بنسبة 0.5٪ في أحد أنابيب قياس التدفق الخلوي واخلطه جيدا.
12. استخدم قياس التدفق الخلوي لقياس التشتت الأمامي ، والتشتت الجانبي ، وتلوين يوديد البروبيديوم (الحد الأقصى للإثارة / الانبعاث عند 535/617 نانومتر) للخلايا المنقاة (الشكل 1).< / > ملاحظه: سيحدد تحليل التشتت الأمامي والجانبي التجمعات غير المرغوب فيها من الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة. سوف يلطخ يوديد البروبيديوم الخلايا ذات غشاء البلازما المخترق فقط ولا ينبغي استخدام PMNs المنقى الذي يحتوي على مجموعات واضحة من الخلايا الإيجابية ليوديد البروبيديوم. في هذه الدراسات ، تم استخدام PMNs المنقاة فقط إذا كانت تشكل >98٪ من الخلايا النقية و <5٪ ملطخة إيجابية ليوديد البروبيديوم.
13. قم بإعداد صفيحة 96 بئرا لمقايسات السمية الخلوية PMN عن طريق طلاء الآبار الفردية التي سيتم استخدامها في هذا الاختبار ب 100 ميكرولتر من المصل البشري المعزول بنسبة 20٪ الذي تم تخفيفه باستخدام DPBS.
    ملاحظه: سيؤدي طلاء PMNs مباشرة على البلاستيك أو الزجاج إلى تنشيط الخلايا. تأكد من تضمين بئر تحكم سلبي واحد على الأقل سيتلقى الوسائط فقط وبئر تحكم إيجابي واحد على الأقل سيتلقى 0.05٪ Triton X-100.
14. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل الآبار المطلية مرتين باستخدام DPBS المثلج لإزالة أي مصل زائد. اضغط برفق على اللوحة رأسا على عقب لإزالة أي بقايا DPBS وضعها على الجليد.
15. أضف برفق 100 ميكرولتر من PMNs البشرية المنقاة بمعدل 1 × 10⁷ خلايا / مل لكل بئر مغلف (1 × 10⁶ PMNs / بئر). اسمح ل PMNs بالاستقرار في الآبار عن طريق احتضان اللوحة على الجليد لمدة 5 دقائق على الأقل. حافظ على مستوى اللوحة للسماح بالتوزيع المتساوي للخلايا في كل بئر واتركها على الجليد لتجنب التنشيط غير المرغوب فيه ل PMNs.

< p class = "jove_title" >2. فحص السمية الخلوية للمكورات العنقودية الذهبية البروتينات خارج الخلية ضد الكريات البيض متعددة الأشكال النووية البشرية

1. استزراع المكورات العنقودية الذهبية طوال الليل في مرق الصويا المشبذب (TSB) باستخدام حاضنة رج مثبتة عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لهذه الدراسات ، تم تلقيح 20 مل من TSB في قوارير Erlenmeyer منفصلة سعة 150 مل بمزارع مجمدة من سلالات S. aureus USA300 أو USA300ΔsaeR / S ونمت لمدة 14 ساعة تقريبا مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
2. الاستزراع الفرعي S. aureus عن طريق إجراء تخفيف 1: 100 للاستزراع البكتيري بين عشية وضحاها باستخدام وسائط جديدة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز حتى تصل البكتيريا إلى مرحلة النمو الثابت المبكرة.
   ملاحظه: بالنسبة لهذه التجارب ، تم تلقيح 20 مل من مرق الصويا التريبتيك في 150 مل من قوارير Erlenmeyer ب 200 ميكرولتر من USA300 أو USA300ΔsaR/S المستزرع طوال الليل واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 5 ساعات.
3. عندما تصل البكتيريا إلى مرحلة النمو الثابت المبكرة ، انقل 1 مل من المكورات العنقودية الذهبية المستزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 5,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى حقنة سعة 3 مل. مرر المواد الطافية عبر مرشح 0.22 ميكرومتر وإلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل على الجليد.
5. إجراء عمليات تخفيفات متسلسلة للمواد الطافية باستخدام وسائط مثلجة تستخدم لاستزراع المكورات العنقودية الذهبية.
   ملاحظه: بالنسبة للتجارب الموضحة ، خضعت المواد الطافية من USA300 و USA300ΔsaeR / S لأربعة تخفيفات متتالية 1/2 لوغاريتمية باستخدام TSB المثلج.
6. أضف برفق عينات طافية أو وسائط بمفردها (للضوابط السلبية والإيجابية) إلى الآبار الفردية المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على PMNs على الجليد من الخطوة 1.15. بالنسبة لهذه التجارب ، تمت إضافة 10 ميكرولتر من عينات الطاف USA300 أو USA300ΔsaeR / S إلى كل بئر. صفيحة صخرية برفق لتوزيع المواد الطافية في الآبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية.
7. في الأوقات المرغوبة ، أخرج الطبق من الحاضنة وضعه على الجليد. أضف 40 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100 إلى بئر التحكم الإيجابي.
8. قم بسحب العينات برفق لأعلى ولأسفل في كل بئر لسحب جميع PMNs الملتصقة باللوحة تماما ، ثم انقل العينات إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي على الجليد التي تحتوي على 300 ميكرولتر من DPBS المثلج مع 1 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم.
9. قم بقياس نسبة PMNs الإيجابية لليوديد البروبيديوم باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2 أ). عندما يرتبط بالحمض النووي ، يكون للبروبيديوم يوديد إثارة / انبعاث عند 535/617 نانومتر.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحليل قياس التدفق الخلوي ل PMNs المنقى. مخططات نقطية لقياس التدفق الخلوي التمثيلي ل (أ) PMNs البشرية المنقاة و (ب) PMNs التي تم تلوثها عمدا بخلايا الدم المحيطية أحادية النواة. (ج) الرسم البياني لقياس التدفق الخلوي التمثيلي الذي يوضح الحد الأدنى من تلطيخ يوديد البروبيديوم (<1٪) من PMNs المنقى (الرمادي المظلل) مقارنة ب PMNs المعالجة بنسبة 0.05٪ Triton X-100 (أحمر مظلل).

< ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم ، USP ، 500 مل حاوية بلاستيكية VIAFLEX باكستر 2ب1323 س تنقية PMN 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع أغطية المفاجئة VWR 89000-044 تستخدم في غسل الخلايا 1.8٪ محلول كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش إس 5150 تنقية PMN أنابيب الثقافة 12x75mm VWR 60818-430 تستخدم كأنابيب قياس التدفق الخلوي 20٪ (وزن/وزن) ديكستران سيجما ألدريتش الطراز D8802 تنقية PMN 3125 عداد الحساب اليدوي المنتجات التي يمكن تتبعها 3125 سي سي لعد الخلايا 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية VWR 89039-656 لتوزيع الوسائط مرق الصويا الترژيتي باكتو ، فول الصويا والكازين Digest Medium فيشر ساينتفيك 211823 لزراعة مزارع الخلايا محاقن BD التي تستخدم لمرة واحدة مع أطراف Luer-Lok ، 3 مل فيشر ساينتفيك 309657 دينار بحريني لتصفية المواد الطاففة مقياس الدم ذو الخط الساطع سيجما ألدريتش Z359629 جهاز عد الخلايا DPBS ، 1x (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) مع الكالسيوم والمغنيسيوم كورنينج 21-030-السيرة الذاتية تستخدم في غسل الخلايا فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-02 تنقية PMN فيشربراند معقم البوليسترين الماصات المصلية القابل للتصرف فيشر ساينتفيك 13-678-11ه لشفط السائل Greiner CELLSTAR 96 ألواح بئر ميليبور سيجما م 0687 لوحة لحمل العينات التجريبية مرشحات حقنة OMICRON أوميكرون العلمي SFPV13R لتصفية المواد الطاففة يوديد البروبيديوم ثيرموفيشر العلمي ص 3566 صبغة الحمض النووي غير المنفذة للغشاء PYREX العلامة التجارية 4980 قوارير Erlenmeyer كول بارمر EW-34503-24 لزراعة مزارع الخلايا RPMI 1640 ، 1X بدون L-glutamine ، أحمر الفينول كورنينج 17-105-السيرة الذاتية تستخدم في إعادة تعليق الخلايا مياه معقمة للري ، USP باكستر 2F7113 تنقية PMN مضخة الماصة منتجات بيل آرت F37898 لشفط السائل تريتون X-100 سيجما ألدريتش X100 التحكم الإيجابي في سلامة الغشاء