فحص السمية الخلوية لسلالات المكورات العنقودية الذهبية على العدلات بعد البلعمة

الملخص

المصدر: Dankoff ، J. G. et al. ، قياس السمية الخلوية للمكورات العنقودية الذهبية ضد الكريات البيض البشرية متعددة الأشكال. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نعرض اختبارا للكشف عن السمية الخلوية لسلالات Staphylococcus aureus الخبيثة والأقل ضراوة ضد العدلات البشرية بعد البلعمة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

فئة

1. مقايسة السمية الخلوية S. aureus ضد الكريات البيض البشرية متعددة الأشكال بعد البلعمة

ملاحظة: يجب تحديد منحنيات النمو المحددة بالكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) وتركيز البكتيريا تجريبيا لاختبار سلالات المكورات العنقودية الذهبية قبل بدء هذا الفحص. يتطلب نجاح هذه التجارب حصادا ثابتا لتركيزات متساوية من كل سلالة من سلالات المكورات العنقودية الذهبية التي تم اختبارها في مرحلة النمو الأسي المتوسطة باستخدام OD600 من البكتيريا المستزرعة الفرعية.

1. ابدأ بين عشية وضحاها مزارع سلالات المكورات العنقودية الذهبية وبكتيريا الزراعة الفرعية كما هو موضح أدناه.
   1. استزراع المكورات العنقودية الذهبية طوال الليل في مرق الصويا المشبذب (TSB) باستخدام حاضنة رج مثبتة عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لهذه الدراسات ، تم تلقيح 20 مل من TSB في قوارير Erlenmeyer منفصلة سعة 150 مل بمزارع مجمدة من سلالات S. aureus USA300 أو USA300ΔsaeR / S ونمت لمدة 14 ساعة تقريبا مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
   2. الاستزراع الفرعي S. aureus عن طريق إجراء تخفيف 1: 100 للاستزراع البكتيري بين عشية وضحاها باستخدام وسائط جديدة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج.
2. حصاد المكورات العنقودية الذهبية المستزرعة الفرعية عندما تصل إلى منتصف النمو الأسي عن طريق نقل 1 مل من البكتيريا المستزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل والطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: في ظل ظروف النمو لدينا ، وصلت USA300 و USA300ΔsaeR / S إلى مرحلة النمو الأسي المتوسطة بعد حوالي 135 دقيقة من الحضانة.
3. اغسل المكورات العنقودية الذهبية بعد الطرد المركزي عن طريق شفط المادة الطافية ، وتعليق البكتيريا المحببة في 1 مل من DPBS ، وتدوير العينة لمدة 30 ثانية ، والطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. Opsonize S. aureus عن طريق تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل من مصل بشري 20٪ مخفف ب DPBS واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع التحريك لمدة 15 دقيقة.
أجهزة
5. الطرد المركزي البكتيريا المضادة للطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل المكورات العنقودية الذهبية بعد الطرد المركزي عن طريق شفط المادة الطافية ، وإعادة تعليق البكتيريا المحببة في 1 مل DPBS ، ثم تدوير العينة حتى يتم تفكيك الحبيبات البكتيرية تماما بالإضافة إلى 30 ثانية إضافية. بكتيريا الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
6. أعد تعليق سلالات المكورات العنقودية الذهبية في 1 مل RPMI، وقم بتدوير العينة حتى تتفكك الحبيبات البكتيرية تماما، ثم لمدة 30 ثانية إضافية.
7. تمييع المكورات العنقودية الذهبية السلالات إلى التركيز المطلوب مع RPMI المثلج. دوامة لمدة 30 ثانية وضعها على الجليد.
8. تأكد من تركيز المكورات العنقودية الذهبية عن طريق طلاء 1:10 التخفيفات التسلسلية للبكتيريا على أجار الصويا التريبتيك.
   ملاحظه: نظرا لأن الاختلافات في تركيز البكتيريا المستخدمة في هذا الاختبار يمكن أن يكون لها تأثير كبير على نفاذية غشاء البلازما PMN اللاحقة (الشكل 1 أ) ، فمن الضروري تحديد تركيز كل سلالة تم اختبارها لكل تجربة ويكون مكافئا بين السلالات.
9. أضف برفق 100 ميكرولتر / بئر من كل سلالة المكورات العنقودية الذهبية أو RPMI (للضوابط الإيجابية والسلبية) إلى PMNs في صفيحة 96 بئرا على الجليد. صفيحة صخرية برفق لتوزيع S. aureus في الآبار.
10. قم بمزامنة البلعمة عن طريق الطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية مباشرة بعد الطرد المركزي (T = 0).
11. في الأوقات المرغوبة ، أخرج الطبق من الحاضنة وضعه على الجليد. أضف 40 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100 إلى بئر التحكم الإيجابي.
12. قم بسحب العينات برفق لأعلى ولأسفل في كل بئر لسحب جميع PMNs الملتصقة باللوحة تماما ، ثم انقل العينات إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي على الجليد الذي يحتوي على 200 ميكرولتر من DPBS المثلج مع 1 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم.
13. تحليل العينات لتلوين يوديد البروبيديوم باستخدام قياس التدفق الخلوي.
14. قياس نسبة PMNs إيجابية يوديد البروبيديوم باستخدام قياس التدفق الخلوي. عندما يرتبط بالحمض النووي ، يكون للبروبيديوم يوديد إثارة / انبعاث عند 535/617 نانومتر.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحليل قياس التدفق الخلوي ل PMNs بعد البلعمة من المكورات العنقودية الذهبية. (أ) نسبة PMNs الإيجابية للبروبيديوم يوديد بعد 90 دقيقة من البلعمة بتركيزات مختلفة من USA300 أو USA300∆saeR / S. (ب) يظهر تركيز المكورات العنقودية الذهبية المضادة للسلالات المستخدمة في التجارب في اللوحة أ. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM من 4 تجارب منفصلة مع * ص ≤ 0...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع أغطية المفاجئة VWR 89000-044 تستخدم في غسل الخلايا أنابيب الثقافة 12x75mm VWR 60818-430 تستخدم كأنابيب قياس التدفق الخلوي 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية VWR 89039-656 لتوزيع الوسائط مرق الصويا الترژيتي باكتو ، فول الصويا والكازين Digest Medium فيشر ساينتفيك 211823 لزراعة مزارع الخلايا مقياس الدم ذو الخط الساطع سيجما ألدريتش Z359629 جهاز عد الخلايا DPBS ، 1x (محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco) مع الكالسيوم والمغنيسيوم كورنينج 21-030-السيرة الذاتية تستخدم في غسل الخلايا فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-02 تنقية PMN فيشربراند معقم البوليسترين الماصات المصلية القابل للتصرف فيشر ساينتفيك 13-678-11ه لشفط السائل Greiner CELLSTAR 96 ألواح بئر ميليبور سيجما م 0687 لوحة لحمل العينات التجريبية مرشحات حقنة OMICRON أوميكرون العلمي SFPV13R لتصفية المواد الطاففة يوديد البروبيديوم ثيرموفيشر العلمي ص 3566 صبغة الحمض النووي غير المنفذة للغشاء PYREX العلامة التجارية 4980 قوارير Erlenmeyer كول بارمر EW-34503-24 لزراعة مزارع الخلايا RPMI 1640 ، 1X بدون L-glutamine ، أحمر الفينول كورنينج 17-105-السيرة الذاتية تستخدم في إعادة تعليق الخلايا تريتون X-100 سيجما ألدريتش X100 التحكم الإيجابي في سلامة الغشاء