تصوير إنزيم المراسل الفلوري لتتبع العدوى البكتيرية في الجسم الحي

الملخص

المصدر: Sharan, R., et al. تصوير المتفطرة السلية في الفئران باستخدام مضان إنزيم المراسل. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تصوير إنزيم المراسل الفلوري (REF) للكشف في الجسم الحي عن عدوى المتفطرة السلية. يتم حقن الفئران المصابة داخل الصفاق بركيزة للتصوير REF. عند تحللها بواسطة إنزيم β-لاكتاماز البكتيري ، تنبعث من الركيزة مضان ، يساعد اكتشافها في تقييم العدوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. السلالات وظروف الثقافة

ملاحظة: تستخدم سلالة المتفطرة السلية CDC1551 في هذه الدراسة، ولكن يمكن استخدام أي سلالة من السل بنفس الطريقة.

1. تنمو البكتيريا في M-OADC-TW (مرق 7H9 مكمل بنسبة 0.5٪ جلسرين ، ومركب سكر العنب بحمض الأوليك بنسبة 10٪ بدون كاتالاز ، و 0.05٪ Tween-80) متوسط يقف عند 37 درجة مئوية إلى OD₆₀₀ من 0.5 (~ 0.2 × 10⁷ وحدة تشكيل مستعمرة أو CFU).
2. تمييع الثقافة في M-OADC-TW ([ر] من 1:10 يخففات من الجراثيم). لوحة تخفيفات البكتيريا (10⁵ ، 10⁶ ، 10 7 ، 10⁸) في ثلاث نسخ على لوحات 7H11 انتقائية للسماح بتحديد CFU.
3. احتضن الصفائح لمدة أربعة أسابيع عند 37 درجة مئوية أو حتى يمكن حساب المستعمرات بدقة.
4. الطرد المركزي اللقاح البكتيري عند 8,534 × جم لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه. اغسل الحبيبات مرة واحدة ب 10 مل من المحلول الملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) وأعد تعليق الحبيبات في 15 مل من المحلول الملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم).

< p class = "jove_title" >2. عدوى الهباء الجوي للفئران باستخدام غرفة ماديسون

1. اسمح للفئران بالتأقلم مع البيئة المحيطة الجديدة لمدة أسبوع.
2. قم بوزن الفئران قبل تحميلها في الغرفة.
3. قم بتوصيل ثلاثة أسلاك بشريط الطاقة: طاقة الغرفة الرئيسية ، ومضخة التفريغ ، وضاغط الهواء ، بهذا الترتيب.
4. قم بفك البرطمان الزجاجي بعناية. أحضر البرطمان الزجاجي إلى خزانة السلامة الحيوية وأضف لقاح التحدي المعلق في 15 مل من المحلول الملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) لتحقيق ~ 10⁴ -^{10 6} CFU من البكتيريا في الرئتين.
5. أغلق غطاء البرطمان الزجاجي في خزانة السلامة الحيوية. قم بتوصيل البرطمان بوحدة البخاخات واضبط أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ العمودي بحيث يكون الطرف السفلي (السحب) أقل بحوالي ربع بوصة من مستوى السائل في البرطمان.
6. قم بتحميل جميع اللازمة للتجربة (يمكن للغرفة أن تستوعب ما يصل إلى 90 فأرا) في الغرفة وأغلق جميع المزالج الموجودة على الباب.
7. تحقق من مقياس تدفق الهواء الرئيسي (الغرفة). تأكد من أن مركز العوامة (الكرة) يعمل حوالي 50 لتر / دقيقة كما تم قياسه على المقياس الموجود على اليسار.
8. اضغط على زر البدء في لوحة التحكم في الغرفة. اضبط معدل تدفق الهواء من خلال مقياس تدفق هواء الضاغط (العداد الأصغر على اليسار) على أنه 4 لتر/دقيقة على الميزان. تحقق بصريا للتأكد من أن لقاح التحدي يتم رذاذه.
9. بعد 15 دقيقة ، عندما يظهر الضوء الأحمر في مقدمة لوحة التحكم وتشير إشارة مسموعة إلى نهاية التشغيل ، اضغط على زر إعادة الضبط في الزاوية اليمنى السفلية من لوحة التحكم لإعادة ضبط المؤقتات.
10. اضغط باستمرار على الزر الأحمر الصغير الموجود على باب الغرفة لتحرير الفراغ.
11. افتح باب الغرفة وأزل. ضع الفئران مرة أخرى في أقفاصها.
12. قم بإزالة وعاء البخاخات الزجاجي وضعه في حاوية نقل محكمة الغلق ومانعة للتسرب. ضع الحاوية داخل خزانة السلامة الحيوية وتخلص من تعليق التحدي في حاوية نفايات مخصصة.
13. ضع جرة البخاخات المستخدمة داخل كيس بيولوجي وأغلق الكيس لنقله إلى الأوتوكلاف.
14. في نهاية إجراء العدوى ، رش الجزء الداخلي من الغرفة بالفينول المخزن و 70٪ من الإيثانول واترك الغرفة بالجلوس لمدة 10 دقائق.
15. بعد ذلك ، امسح جميع الأسطح الداخلية التي يمكن الوصول إليها جيدا. تخلص من جميع المناشف الورقية الملوثة ، إلخ. في سلة المهملات البيولوجية. قم بتعقيم سلة المهملات وحاويات النفايات وأوعية البخاخات المستخدمة.
16. ضع مرة أخرى في غرفة الاحتواء حتى النقطة الزمنية للتصوير.
17. في يوم التصوير ، انقل في حاوية ثانوية إلى غرفة التصوير.

فئة

3. التخدير الحيواني

1. تخدير الفئران بالأيزوفلوران باستخدام نظام تخدير الغاز المخصص.
2. قم بوزن كل من علبتي فلتر الفحم الموجودة أعلى وحدة التخدير.
3. استبدلها بعلبة جديدة إذا كان الوزن أعلى بمقدار 50 جراما من الوزن الأولي.
4. تحقق من وحدة المرذاذ للتأكد من الأيزوفلوران الكافي للإجراء.
5. ضع حامل مخروط الأنف داخل حجرة التصوير. ضع عدد مخاريط الأنف المطلوبة للإجراء وأغلق الفتحات المتبقية باستخدام حاصرات مخروط الأنف.
6. قم بتشغيل مصدر الأكسجين من أسطوانة الضغط العالي واضبطه على 55 رطل لكل بوصة مربعة.
7. قم بتشغيل مضخة التفريغ الموجودة أمام وحدة التخدير واضبطها على 8 لتر / دقيقة.
8. قم بتشغيل مفتاح الأكسجين الموجود أمام وحدة التخدير.
9. قم بتشغيل تدفق الغاز إلى غرفة تحريض التخدير لضبط تدفق الغاز على 1.5 لتر / دقيقة.
10. قم بتشغيل تدفق الغاز إلى غرفة التصوير لضبط تدفق الغاز على 0.25 لتر/دقيقة.
11. قم بتشغيل مبخر الأيزوفلوران واضبطه على 2 - 2.5٪. اضبط مستوى الأيزوفلوران وفقا لعدد ووزن المستخدمة في التجربة عن طريق تدوير القرص على مبخر الأيزوفلوران (2 - 2.5٪ للفأر الذي يزن ~ 20 جم ؛ 4٪ لخنزير غينيا الذي يزن 300 جرام).
12. ضع الفئران في حجرة التخدير وأغلق الغطاء. قم بتشغيل تدفق الغاز إلى غرفة تحريض التخدير.
13. اترك الفئران في غرفة تحريض التخدير لمدة 5-10 دقائق حتى تخدر تماما.
14. بمجرد تخدير الفئران ، ضع مرهما بصريا على العينين لحمايتها أثناء التصوير.
15. ضع الفئران في الاستلقاء البطني أو القصي بحيث يتم وضع أنوفها في مخروط الأنف لتسهيل تخدير الفئران أثناء إجراء التصوير.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تصوير إنزيم المراسل الفلوري (REF)

1. حقن الركيزة (20 ميكرومتر ، 2.5 ميكرولتر / غرام من الوزن) عن طريق الحقن داخل الصفاق في الفئران المصابة وكذلك الفئران الضابطة. تخضع الفئران للتخدير داخل غرفة التصوير لمدة تقل عن دقيقة واحدة.
2. ابدأ تشغيل نظام التصوير.
3. قم بتهيئة النظام بالنقر فوق تهيئة. انتظر حتى يتحول شريط درجة الحرارة إلى اللون الأخضر.
   ملاحظه: تتكون غرفة التصوير من منصة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة جسم أثناء التصوير.
4. لإعداد الحصول على التصوير، حدد الفلورسنت | عبر الإضاءة للحيوان بأكمله أو إضاءة Epi لأنسجة الرئة والهيكل والتراكب في لوحة التحكم في الاستحواذ.
5. اضبط مجال الرؤية على B لماوس واحد ومستوى المصباح على مرتفع.
6. اضبط وقت التعريض الضوئي على تلقائي ، ومتوسط ، و2 - 3 ل f / stop ، ومرشح الإثارة على 745 نانومتر ومرشحات البث من 780 نانومتر إلى 840 نانومتر.
7. لإعداد التسلسل ، انقر فوق إعداد التسلسل ، وحدد 9 - 12 نقطة إضاءة عابرة في منطقة الرئة.
8. انقر فوق الحصول على للحصول على الصور.
9. ضع الماوس مرة أخرى في القفص بعد التصوير.
10. راقب الفئران حتى تتعافى تماما أو ضحية بها لقياس CFU إذا كان التصوير في نقطة زمنية من التجربة. قم بإجراء درجة كارنوفسكي المعدلة لمراقبة رفاهية الفئران بعد التصوير.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات إيزوفلوران فيتون 501027 CNIR800 مركب مخصص حل Fatal Plus Vortech الصيدلانية Ls، المحدودة 7H9 مرق ميدلبروك دينار بحريني هاتف: 271310 إثراء OADC Middlebrook دينار بحريني 212351 سبورسيدين RE-1284F 7H11 ميدلبروك أجار دينار بحريني 212203 ماديسون تشامبر طيف IVIS بيركين إلمر 124262 نظام تخدير الغاز XGI-8 بيركين إلمر برنامج التصوير الحي بيركين إلمر مخاريط الأنف الشفافة بيركين إلمر سلالة M. السل CDC1551 ATCC أنثى الفئران BALB / C ، 5-7 أسابيع مختبر جاكسون