تقييم ضراوة الليشمانيا داخل الضامة المستنبتة

الملخص

المصدر: Sarkar, A. et al., القياس الكمي للنمو داخل الخلايا داخل البلاعم هو طريقة سريعة وموثوقة لتقييم ضراوة الليشمانيا} الطفيليات. J. Vis. Exp. (2018)

يبحث هذا الفيديو في ضراوة لمرض الليشمانيا عن طريق معالجة البلاعم باستخدام البلاعم الحلوية ، مما يؤدي إلى تكوين المايجوت داخل الخلايا. يتم تأكيد ضراوة ليشمانيا من خلال تلطيخ صبغة الفلورسنت بالحمض النووي. يمكن أن تساهم هذه البصيرة في تطوير علاجات جديدة لداء الليشمانيات.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل وتمايز الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMMs)

1. اليوم 0: التضحية بأنثى C57BL / 6 البالغة من العمر 6 أسابيع أو فأر BALB / c في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ وتأكيد الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم. تأكد من تعقيم المقص والملقط عن طريق إبقائها غارقة في 70٪ من الإيثانول. رش القفازات بنسبة 70٪ من الإيثانول للسماح بالتعامل معقم طوال عملية عزل خلايا نخاع العظم.
2. قم بتثبيت الفأر المضحى به على لوحة التشريح عن طريق تثبيت أطرافه الأمامية وتطهيرها عن طريق رشها بكثرة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. قم بعمل شق صغير (حوالي 1 سم) بمقص بالقرب من مفصل الورك. أدخل المقص بحذر تحت الجلد لفصل العضلة الأساسية وقطع الجلد حول مفصل الورك. < / > ملاحظه: يمكن تدوير لوحة التشريح للسماح بتحسين الوصول إلى مفصل الورك.
4. قم بإزالة القفاز بعناية من الجلد من الساق عن طريق السحب نحو الكاحل وإزالته. اقطع القدم عند الكاحل ، مع الحرص الشديد على قطع مفصل الكاحل أو تحته لترك الساق سليمة تماما. < / > ملاحظه: يتم ربط الشظية في هذه المرحلة بشكل فضفاض ويمكن فصلها بسهولة باستخدام الملقط.
5. حدد موقع مفصل الورك يدويا عن طريق التلاعب بعظم الفخذ لتحديد نقطة الدوران. استخدم المقص بعناية لقطع الساق فوق مفصل الورك لترك الرأس القريب من عظم الفخذ سليما.
6. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والأنسجة الضامة من الساق بالمقص. قم بإزالة أي جلد متبقي من الكاحل وأي مادة عظمية زائدة فوق مفصل الورك.
7. ضع عظام الساق التي تم تنظيفها في معهد روزويل بارك التذكاري المعقم RPM المكمل بالبنسلين / الستربتومايسين (تركيز نهائي 1٪) في طبق بتري على الثلج.
8. كرر الخطوات من 1.4 إلى 1.6 لعزل الساق وعظم الفخذ عن الساق الخلفية الأخرى.
9. قم بإزالة أي عضلة وأنسجة ضامة متبقية من العظام المنقعة في RPMI باستخدام ملقط معقم وشفرة معقمة # 10.
10. ضع العظام على غطاء طبق بتري. اقطع الساق بعناية باستخدام الشفرة الموجودة فوق مفصل الكاحل مباشرة للوصول إلى النخاع. قم بإزالة الساق من باقي الساق عن طريق القطع أسفل مفصل الركبة مباشرة.
11. اسحب 10 مل RPMI معقم مكمل بالبنسلين / الستربتومايسين (تركيز نهائي 1٪) في حقنة سعة 10 مل وقم بإرفاق إبرة 25 جرام.
12. أمسك الساق بقوة باستخدام ملقط ، عموديا فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل على الجليد. استخدم المحقنة لحقن ما يقرب من 5 مل RPMI برفق في نهاية العظم لطرد نخاع العظم من الطرف الآخر إلى الأنبوب المخروطي. اغسل نخاع العظم بإجمالي 10 مل RPMI حتى يتحول لون العظم إلى اللون الأبيض. < / > ملاحظه: بعد التنظيف الشامل ، يجب أن يتحول لون العظم إلى اللون الأبيض. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستمر في التنظيف لإزالة النخاع. قد يلزم قطع الطرف البعيد من الساق مرة أخرى بالشفرة إذا كانت ضيقة جدا لإدخال الإبرة.
13. قطع عظم الفخذ مباشرة فوق مفصل الركبة وأسفل مفصل الورك مباشرة لكشف طرفي العظم للوصول إلى النخاع. اغسل نخاع العظم من عظم الفخذ بإجمالي 10 مل RPMI بنفس طريقة الظنبوب.
14. كرر خطوات التنظيف والتنظيف من 1.6 إلى 1.13 مع العظام المتبقية واجمع الخلايا المتدفقة من نخاع العظم في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل
    ملاحظه: إذا انكسر العظم في أي وقت أثناء التشريح قبل تنظيف العظام ، فلا تستخدم النخاع من هذا العظم.
15. جهاز الطرد المركزي ، الأنبوب المخروطي المستخدم لجمع نخاع العظام ، الذي تم شطفه من جميع العظام الأربعة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية عند 300 × جم.
16. ضع 60 مل من وسط BMM المعقم (RPMI بتركيز نهائي من 20٪ مصل بقري جنين ، FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 1.2 ملي Na-pyruvate ، 25 ميكروغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم البشري (M-CSF) في قارورة زراعة خلية 175 سم² مع غطاء مرشح.
17. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام 5 مل من وسط BMM من القارورة.
18. انقل تعليق الخلية إلى قارورة الثقافة واشطف الأنبوب المخروطي مرتين باستخدام وسط BMM من قارورة المزرعة لضمان أقصى قدر من التعافي للخلايا. تأكد من خلط معلق الخلية جيدا في وسط ، وقم بتوزيع 30 مل من قارورة زراعة الخلية الأولية مقاس 175 سم² إلى قارورة ثقافة خلية ثانية مقاس 175 سم² مع غطاء مرشح.
19. احتضان كلا القوارير التي تحتوي على 30 مل معلق خلوي كل بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) للسماح بفصل أي خلايا ليفية ملوثة ، والضامة المقيمة ، والخلايا الملتصقة الأخرى.
20. اليوم 1: انقل المادة الطافية التي تحتوي على خلايا نخاع العظم غير المتمايزة من القوارير إلى أطباق بتري البوليسترين غير المعالجة ب TC مقاس 100 مم × 15 مم عند حوالي 10 مل / طبق وتحتضنها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.تخلص من القوارير.
21. اليوم 3 أو 4: أضف 5 مل إضافي من وسط BMM (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) إلى كل طبق بتري واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

< p class = "jove_title" >2. طلاء BMMs على أغطية للعدوى (اليوم 7 أو 8)

1. قم بإعداد ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار عن طريق وضع أربع (4) أغطية زجاجية معقمة مقاس 12 مم (معقمة ومخزنة في وعاء زجاجي مغلق) في قاع كل بئر فارغ. < / > ملاحظه: اختر كل غطاء معقم مقاس 12 مم بطرف شفط مثبت على خط تفريغ. ضع الغطاء في الآبار دون تداخل ، وحررها في الموضع المطلوب عن طريق الضغط على الأنبوب لمقاطعة الفراغ.
2. وسائط الشفط (وأي خلايا غير ملتصقة) من أطباق بتري المغلفة بالبلاعم الملتصقة المشتقة من نخاع العظام وشطف الخلايا الملتصقة برفق 2x باستخدام محلول ملحي معقم من فوسفات Dulbecco بدون كالسيوم وكلوريد المغنيسيوم (PBS -/-) دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
3. أضف 5 مل معقمة 1x PBS -/- بتركيز نهائي قدره 1 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) إلى كل طبق بتري واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل BMMs الملتصقة. تحقق من فصل الخلايا باستخدام المجهر.
4. اجمع جميع الخلايا المنفصلة المعلقة في 1x PBS -/- مكملة ب 1 ملي مولار EDTA في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اشطف كل طبق 2x مع 5 مل PBS -/- وأضفه إلى حوض تعليق الخلية.
   ملاحظه: يمكن تخفيف تعليق الخلية باستخدام PBS إضافي -/- لحماية البلاعم من سمية EDTA أثناء عملية التجميع.
5. جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق البلاعم في وسط 5-10 مل BMM عن طريق سحب العينات. ضع الخلايا المعلقة على الجليد لمنع الالتصاق بالأنابيب والتكتل.
6. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد Trypan blue في مقياس كثافة الدم.
   ملاحظه: لحساب خلايا BMM المعلقة في وسط 5 مل ، يسمح مزيج التخفيف من 25 ميكرولتر من تعليق الخلية في 445 ميكرولتر PBS -/- و 30 ميكرولتر 0.4٪ محلول تريبان الأزرق عادة بالقياس الكمي السهل في مقياس كثافة الدم (مع مراعاة عامل تخفيف 20x للحساب النهائي). عد فقط الخلايا التي لم تلطخ باللون الأزرق التريبان (خلايا قابلة للحياة). قد يتغير حجم تعليق الخلية إذا كان هذا الخليط شديد التركيز أو المخفف. بشكل عام ، يتراوح إنتاجية BMM لكل مستحضر بين 2 × 10⁷ و 5 × 10⁷ خلايا من فأر واحد.
7. قم بإعداد تعليق الخلية في وسط BMM بتركيز الطلاء المطلوب (5 × 10⁵ / مل) وتفريق التعليق إلى 6 ألواح بئر في وسط 2 مل لكل بئر بحيث يتلقى كل بئر 1 × 10⁶ ضامة. < / > ملاحظه: هذه خطوة حاسمة تضمن حصول كل بئر على عدد كاف من البلاعم لتغطية الغطاء بشكل موحد. تأكد من أن أغطية الآبار غير متداخلة أو عائمة في الوسط. إذا كان الأمر كذلك ، فاضبطه برفق باستخدام طرف ماصة معقمة.
8. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

< p class = "jove_title" >3. تنقية الأشكال المعدية لمرض الليشمانيا أمازون

ملاحظة: تحضير الليشمانيا للعدوى - تنقية promastigotes metacyclic من مزارع promastigote الثابتة ، أو تمييز promastigotes في الثقافة إلى شكل amastigote باستخدام بروتوكول التمايز المحوري L. amazonensis.

1. تنقية البروماستيجوت المتحولة الحلقية ليشمانيا باستخدام وسائط تدرج الكثافة (المواد)
   1. قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 40٪ من وسائط التدرج الكثافة في ماء معقم وخالي من السموم الداخلية.
   محلول
   2. تدرج الكثافة المخفف في وسط 10x M199 (بدون مصل) لتحضير تركيز 10٪ في وسط M199.
   3. قم بتصفية جميع المحاليل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظه: يمكن تخزين محاليل المخزون في درجة حرارة 4 ^درجاتمئوية في الظلام لمدة لا تزيد عن شهر واحد.
   4. أضف 2 مل من محلول وسائط التدرج الكثافة بنسبة 40٪ في قاع أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل.
   5. طبقة 2 مل من محلول وسائط التدرج الكثافة بنسبة 10٪ في M199 فوق طبقة الوسائط المتدرجة كثافة 40٪ بعناية، باستخدام ماصة باستور لتجنب أي خلط بين الطبقتين.
   6. اجمع 1 × 10⁹ طفيليات من استزراع الطور الثابت عن طريق الطرد المركزي عند 1,900 × جم لمدة 10 دقائق.
   7. أعد تعليق الخلايا في الوسط الأساسي المعدل (DMEM) من Dulbecco سعة 6 مل.
   8. طبقة 2 مل من تعليق الخلية مباشرة فوق طبقة الوسائط المتدرجة الكثافة 10٪، برفق، باستخدام ماصة باستور لتجنب الاختلاط بين الطبقات.
   9. جهاز الطرد المركزي التدرج لمدة 10 دقائق عند 1,300 × جم في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظه: نظرا للاختلافات في الخصائص الفيزيائية بين أنواع الليشمانيا ، قد يتعين تعديل ظروف الطرد المركزي لكل منها بشكل طفيف لضمان أقصى إنتاجية.
   10. اجمع الطفيليات (المخصبة في شكل بروماستيجوت metacircleic) من النطاق المتكون عند الحد العلوي لوسط التدرج الكثافة 10٪ (الواجهة بين طبقات وسائط التدرج الكثافة 0٪ و 10٪).
   11. تمييع الطفيليات بحجم واحد من DMEM وتجميعها بالطرد المركزي (1,900 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة).
   12. أعد التعليق في وسط DMEM سعة 500 ميكرولتر واعدها في مقياس كثافة الدم لتحديد المحصول.
2. توليد L. amazonensis amastigotes في ظل ظروف الاستزراع المحوري (درجة الحموضة المنخفضة / درجة الحرارة المرتفعة)
   1. امزج 5 مل من مزرعة بروماستيجوت في الطور اللوغاريتمي (درجة الحموضة 7.4 عند 26 ^درجةمئوية) مع حجم متساو من وسط amastigote (درجة الحموضة 4.5) ، باستخدام قوارير^{25 سم 2} (إجمالي 10 مل متوسط) ، واحتضانها عند 26 درجة مئوية طوال الليل.
   2. قم بتحويل القارورة من 26 درجة مئوية إلى 32 درجة مئوية.
   3. بعد 3 أو 4 أيام ، قم بتقسيم الثقافة 1: 5 في وسائط amastigote عند 32 درجة مئوية.
   4. افحص الطفيليات في الأيام الثلاثة إلى الأربعة القادمة (بحد أقصى 7 أيام) لمعرفة ما إذا كانت جاهزة للاستخدام في العدوى. < / > ملاحظه: يجب أن يكون للأسيستيغوت المحورية الصحية شكل بيضاوي ، بدون سوط مرئي. الآماستيجوت المتمايزة جزئيا لها شكل بيضاوي كبير مع سوط قصير. لا ينبغي أن تحتوي الثقافة على الكثير من الكتل - فالعديد من الكتل هي مؤشر على الطفيليات غير النامية والمحتضرة. يمكن تقسيم ثقافة amastigote 1: 5 والحفاظ عليها لمدة أقصاها 3 أسابيع.

< p class = "jove_title" >4. العدوى ب L. amazonensis

1. معلقات الطفيليات المخففة وفقا لتعدد العدوى المطلوب (MOI) (عادة 3-5 promastigotes metacyclic لكل بلاعم [MOI من 1: 3 أو 1: 5] و 1 amastigote لكل بلاعم [MOI 1: 1]). أضف الليشمانيا في PBS -/- بحجم 50 - 100 ميكرولتر لكل بئر يحتوي بالفعل على 2 مل متوسط.
2. احتضان BMMs لمدة 1 ساعة مع amastigotes و 3 ساعات مع promastigotes metacyclic عند 34 ^{درجة مئوية}للعدوى.
   ملاحظه: قد تختلف درجة حرارة العدوى المثلى حسب الأنواع.
3. بعد الحضانة ، اغسل الطفيليات الحرة جيدا في كل بئر 3x مع 2 مل PBS -/- دافئة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
   ملاحظه: قم بتفريق PBS برفق للتأكد من أن الأغطية لا تطفو فوق بعضها البعض. حرك اللوحة برفق ثم استنشق السائل. استخدم طرف شفط منفصل إذا كنت تستخدم سلالات متعددة من الطفيليات لتجنب التلوث المتبادل.
4. قم بإصلاح عينات النقطة الزمنية لمدة 1 ساعة أو 3 ساعات عن طريق احتضان كل بئر ب 1.5 - 2 مل من 2٪ PFA في PBS -/- لمدة 10 دقائق. لا تشفط الغسيل الأخير وقم بتبريد الأطباق التي تحتوي على أغطية في PBS حتى تلطيخها.
5. أضف 2 مل من متوسط BMM الطازج إلى كل بئر على الأطباق لمزيد من النقاط الزمنية واحتضانها عند 34 درجة مئوية.
6. قم بإصلاح النقاط الزمنية المتبقية حسب الرغبة كما هو موضح في الخطوة 4.3 ، وقم بتبريد الأطباق حتى تلطخها.

فئة

5. 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) تلطيخ وتصاعد Coverslip

1. قم بشفط PBS من الآبار التي تحتوي على أغطية وأضف 1.5 مل PBS -/- مع 0.1٪ منظف غير أيوني. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بغسل 3 مرات مع 2 مل PBS -/-.
2. أضف 1 مل من PBS -/- مع 2 ميكروغرام / مل DAPI (مخفف من محلول مخزون 5 مجم / مل في الماء) إلى الآبار التي تحتوي على أغطية واحتضانها لمدة ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يعد وقت الحضانة باستخدام DAPI أمرا بالغ الأهمية للتصور الصحيح لطفيليات الليشمانيا داخل الخلايا. تلطخ نوى البلاعم بسرعة ، نظرا لحجمها الأكبر ومحتواها من الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) ولكن تلطيخ نوى الطفيليات داخل الخلايا يكون أبطأ. وبالتالي ، فإن تمديد وقت الحضانة إلى ما هو أبعد مما هو مطلوب لتصور نوى BMM ضروري للسماح ل DAPI بالتغلغل عبر غشاء البلازما الطفيلي والغشاء النووي الطفيلي. مع صبغة DAPI المناسبة ، يمكن أيضا تصور الحمض النووي الحركي للميتوكوندريا بالقرب من جيب السوط للطفيلي ، بالإضافة إلى الحمض النووي النووي.
3. اغسل كل بئر يحتوي على أغطية 3x باستخدام 2 مل PBS -/- ثم ارفع الغطاء واقلبه بالملقط لوضع جانب الخلية لأسفل وتثبيته على شرائح المجهر الزجاجي باستخدام كاشف تثبيت مضاد للبهتان متاح تجاريا. < / > ملاحظه: أغطية الهشة للغاية وتحتاج إلى معالجة حذرة. تجنب الضغط عليها ، خاصة على الجدار الجانبي للآبار عند الرفع. تؤدي إضافة بضع قطرات من PBS -/- إلى تقليل التوتر السطحي بين الغطاء والبئر وتسهيل عملية الرفع. يمكن استخدام إبرة قياس دقيقة للمساعدة في استخراج الغطاء من قاع البئر. بعد وضع غطاء على الشريحة ، اضغط برفق لأسفل باستخدام ملقط لدفع أي فقاعات هواء في وسائط التثبيت. إذا كان الغطاء مكسورا أو ربما انقلب أثناء عملية الرفع ، فلا تقم بإعادة التركيب. ما عليك سوى استخدام الغطاء الرابع الاحتياطي.
4. ضعي الشرائح في الثلاجة حتى القياس الكمي.

< p class = "jove_title" >6. القياس الكمي للعدوى

1. افحص الشرائح الملطخة ب DAPI تحت المجهر الفلوري من خلال التركيز على البلاعم باستخدام عدسة موضوعية 100X مع زيت الغمر (الإثارة عند 358 نانومتر ؛ الانبعاث الأمثل عند 461 نانومتر).
   تأكد من أن التركيز ينصب على طبقة البلاعم بين الشريحة الزجاجية والغطاء.
2. حدد عدد البلاعم (النوى الكبيرة الملطخة ب DAPI) وعدد نوى البلاعم الأصغر المتجمعة حول كل نواة ضامة (انظر الشكل 1 أ ، DAPI) لكل مجال رؤية ، باستخدام عداد يدوي.
   ملاحظه: قد لا تكون جميع نوى Amastigote مرئية في مستوى واحد من التركيز نظرا لصغر حجمها. احسب تلك التي تكون مرئية عند التركيز على نوى البلاعم ، ثم استخدم التركيز الدقيق للتحقق من نوى الطفيليات في مستويات أعلى وأسفل نوى البلاعم.
3. انتقل إلى مجال رؤية آخر لتكرار القياس الكمي. استخدم مفتاح عداد منفصل لتتبع عدد الحقول التي تم جربها. تنقل عبر الحقول المرئية في صفوف متوازية عبر كل قسيمة غطاء، لمنع تداخل العد.
4. حدد ما لا يقل عن 200 بلاعم لكل قسيمة غطاء. حدد كل نقطة زمنية للعدوى بثلاث نسخ (3 أغطية). عد الغطاء الرابع إذا كان أحد الأجزاء السابقة غير مناسب للعد بسبب تداخل الغطاء ، أو التركيب السيئ ، أو كسر الزجاج ، وما إلى ذلك <br / > ملاحظه: إذا تعذر حساب 200 وحدة من البلاعم على أي غطاء واحد ، فاحسب الربع الاحتياطي.
5. احسب معدلات الإصابة على أنها / بلاعم أو أماستيجوت / 100 ضامة وحدد النسبة المئوية للبلاعم المصابة من بيانات القياس الكمي الأولية.

النتائج

الشكل 1: رسم توضيحي تمثيلي لعدوى BMM مع المايستيجوت المحوري الخبيث (A) وpromastigotes غير الخبيثة في المرحلة اللوغاريتمية (B) من L. amazonensis. صور التألق المناعي للبلاعم المعزولة من BALB / c الفئران ، 1 ساعة و 48 ساعة بعد الإصابة. تمت معالجة البلاعم المصابة للتألق المناعي كما هو موضح في البروتوكول. تم تلطيخ الأغشية الكهروضوئية بجسم مضاد أحادي النسيلة Lamp1 المضاد للفئران (تخفيف...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
6 لوحة زراعة خلايا البئر	Cellstar	657160
الأدينين	Acros Organics	AC147440250
أطراف ماصة حاجز الهباء الجوي (100-1000 ميكرولتر)	فيشربراند	02-707-404
أطراف ماصة حاجز الهباء الجوي (20-200 ميكرولتر)	فيشربراند	02-707-430
أطراف ماصة حاجز الهباء الجوي (2-20 ميكرولتر)	فيشربراند	02-707-432
شفرة جراحية من الفولاذ الكربوني من Bard-Parker Rib-Back # 10	أسبن الجراحي	371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL حقنة	بيكتون ديكنسون (BD)	309604
إبرة BD Precisionglide ، 25G	بيكتون ديكنسون (BD)	305124
طبق زراعة الخلية 35 مم × 10 مم	Cellstar	627 160
قارورة ثقافة الخلية	Cellstar	660175
نظارات الغطاء: دوائر 12 مم	فيشربراند	12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
د-بيوتين	جي تي بيكر	C272-00
EDTA	سيجما ألدريتش	EDS
الكحول الإيثيلي 200 برهان	Pharmco-AAPER	111000200
صقر 100 مم × 15 مم صحن بتري بوليسترين غير معالج ب TC	كورنينج	351029
مصل الأبقار الجنينية	Seradigm	1500-500
Ficoll400	سيجما ألدريتش	F8016
المجهر الفلوري	نيكون	E200
الماعز المضاد للفأر IgG تكساس الأحمر	Invitrogen	T-862
الماعز المضاد للأرانب IgG AlexaFluor488	Invitrogen	أ-11034
Hemin	شركة طوكيو للصناعات الكيميائية المحدودة	H0008
هيبس (1M)	جيبكو	15630-080
Isoton II مخفف	بيكمان كولتر	8546719
L-جلوتامين	الجوزاء	400-106
متوسط 199 (10X)	جيبكو	11825-015
Na pyruvate (100 mM)	جيبكو	11360-070
بارافورمالدهايد	ألفا إيسار	43368
البنسلين / الستربتومايسين	الجوزاء	400-109
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (-/-)	ثيرموفيشر	14200166
أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبلين 15 مل	Cellstar	188 271
أنابيب الطرد المركزي المخروطية من مادة البولي بروبلين 50 مل	Cellstar	227 261
كاشف ProLong Gold المضاد للتلاشي	ثيرموفيشر	P36930
الجسم المضاد للفئران مصباح 1	دراسات التنمية بنك الورم الهجين	1D4B
M-CSF البشري المؤتلف	PeproTech	300-25
مقياس الدم Reichert Bright-Line	هوسر العلمي	1492
RPMI متوسط 1640 (1X)	جيبكو	11875-093
Triton X-100 خافض للتوتر السطحي	ميليبور سيجما	TX1568-1
تريبان بلو	سيجما ألدريتش	T8154
مقص رقيق ، 4 1/2 بوصة	VWR	82027-582
تشريح الملقط ، طرف ناعم	VWR	82027-386
شرائح المجهر	VWR	16004-368
Z1 كولتر عداد الجسيمات, عتبة مزدوجة	بيكمان كولتر	6605699