$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. مرور الثقافات العضوية
- أضف 1 مل من الوسط القاعدي البارد إلى مصفوفة الطابق السفلي في البئر. باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل ، قم بتحريك الماصة بقوة لأعلى ولأسفل حتى يتم تفكيك المصفوفة السفلية. انقله إلى أنبوب سعة 15 مل. ضعها على الثلج.
- امتص العضيات في الماصة وقم بعمل ماصة بقوة 10 أضعاف لأعلى ولأسفل. يمكن ملاحظة كسر العضيات عن طريق العين.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. الحقن المجهري للثقافة العضوية.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول لحقن البكتيريا الدقيقة في العضيات. قد يكون من المفيد أن تبدأ الحقن مع العضيات التي هي أكثر تساهلا للحقن المجهري. على سبيل المثال ، يمكن أن تنمو عضيات المعدة في الفأر إلى عضيات كيسية كبيرة جدا يسهل استهدافها.
- تحضير المواد
- اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية إلى إبرتين للحقن باستخدام مجتذب ماصة دقيقة، وفقا لتوصيات الشركات المصنعة. سيقوم مجتذب الماصة الدقيقة بتسخين الشعيرات الدموية الزجاجية في المنتصف وسيسحب الشعيرات الدموية إلى جزأين ، وبالتالي توليد إبرتين زجاجيتين. من العملي سحب عدة إبر وتخزينها في طبق بتري نظيف.
- للسماح بالعدوى البكتيرية ، قم بإزالة المضادات الحيوية من جميع الوسائط لمدة 3 تغييرات متوسطة على الأقل (= أسبوع واحد). سيؤدي ذلك إلى تخفيف المضادات الحيوية من مصفوفة الطابق السفلي. إذا كنت تستخدم سلالة بكتيرية مقاومة لمضاد حيوي معين ، أضف هذا المضاد الحيوي المحدد لتقليل فرص التلوث.
- تحضير طاولة العمل للحقن المجهري. للعمل على مستويات مختلفة من السلامة البيولوجية ، قد يكون من الضروري وضع مجهر مجسم داخل مقعد معقم. في هذا البروتوكول ، حقن الملوية البوابية تحت ظروف السلامة البيولوجية من المستوى 2 تحت مجهر مجسم داخل مقعد معقم.
- زراعة البكتيريا وفقا للبروتوكولات القياسية.
- لتقدير تعدد العدوى (MOI) ، قم بتقدير معلمتين: عدد البكتيريا وعدد الخلايا لكل عضوية كما هو موضح أدناه. يمكن أن يرتبط وزارة الداخلية بالنتائج ، على سبيل المثال مع تعبير المضيف IL-8 mRNA.
- لحساب الكثافة البكتيرية في محلول العدوى ، قم أولا بإنشاء المنحنى القياسي للكثافة الضوئية ووحدات تشكيل المستعمرة (CFU) وفقا للبروتوكولات القياسية. يجب أن تنتج الكثافة البصرية البالغة 0.1 عند 550 نانومتر حوالي 107 CFU / ml.
- لتقدير عدد الخلايا لكل عضوية ، احسب عدد العضيات في 1 بئر. تعطيل العضيات كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.4. بعد الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم و 4 درجات مئوية ، أضف 1 مل من محلول التفكك الأنزيمي وأعد تعليقه.
- احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج المتكرر لمدة 5-10 دقائق. حدد ما إذا كانت الخلايا قد تفككت إلى خلايا مفردة تحت المجهر (المجهر المقلوب مثل Leica DMIL بتكبير 10 أضعاف). إذا لزم الأمر إطالة فترة الحضانة.
- عد الخلايا لكل عضوية باستخدام مقياس الدم واحسب عدد الخلايا لكل عضوية. تحتوي عضيات المعدة البشرية التي يبلغ قطرها حوالي 200 ميكرومتر على ما يقرب من 4,000 خلية. ينتج عن حقن 0.2 ميكرولتر من محلول بكتيري مع 1 × 109 بكتيريا لكل مل وزارة داخلية تقريبية تبلغ 50.
- حقن العضيات.< / >
ملاحظة: بالنسبة للحقن المجهري ، يتم تثبيت الإبرة الزجاجية في حامل ، والذي يمكن المناورة به في 3 أبعاد بواسطة معالج دقيق. تبقى العضيات داخل مصفوفة الطابق السفلي داخل البئر. نظرا للحجم والوضع في البئر ، ليست كل العضيات قابلة للحقن على قدم المساواة. عادة ، يمكن استهداف أكبر 30 عضوا في بئر واحد في 5 دقائق.
- حصاد البكتيريا واغسلها في الوسط القاعدي وفقا للبروتوكولات القياسية.
- احسب عدد البكتيريا لكل مل وفقا للكثافة البصرية (انظر الخطوة 2.1.5.1). خفف البكتيريا إلى 1 × 109 بكتيريا لكل مل في وسط قاعدي.
- خذ إبرة زجاجية. باستخدام الملقط ، قم بكسر الطرف بحيث يكون عرض الفتحة حوالي 10 ميكرومتر.
- أدخل الإبرة في حامل الحقن وثبتها في جهاز المعالجة الدقيقة.
- امتص ما يقرب من 10 ميكرولتر من المحلول البكتيري في الإبرة.
- ضع صفيحة من 4 آبار ذات حواف منخفضة تحتوي على مزارع عضوية تحت المجهر المجسم.
- التنقل باستخدام المعالج الدقيق ، استهدف عضوا واحدا بالإبرة. ضع الإبرة بالقرب من العضوية ثم أدخل الإبرة في العضوية بحركة واحدة سريعة. حقن ما يقرب من 0.2 ميكرولتر محلول بكتيري في كل عضو باستخدام الحاقن الدقيق.
< p class = "jove_title" >
3. حصاد العضيات لأي تحليل.
- على سبيل المثال ، قم بإصلاح العضيات بعد 4 ساعات. قم بإزالة المادة الطافية وإضافة 1 مل 2٪ فورمالديهايد واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.