تقييم النمو داخل الخلايا للطفرات Coxiella داخل الخلايا حقيقية النواة

الملخص

المصدر: Martinez، E. et al.، الجيل وفحص المحتوى العالي متعدد الأنماط للطفرات الينقولات Coxiella burnetii.J. Vis. Exp.(2015)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتقييم النمو داخل الخلايا لطفرات Coxiella الموسومة ب GFP داخل الخلايا الظهارية المستنبتة. يتم تصور النمط الظاهري المتحور باستخدام الفحص المجهري المناعي والتلوين ، مما يسمح بدراسة تأثير الطفرة على النمو داخل الخلايا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد مكتبة من بروتين التألق الأخضر ، طفرات الينقولات Coxiella الموسومة ب GFP

التلاعب ب Coxiella burnetii RSA439 NMII في مستوى احتواء السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) في خزانة السلامة الميكروبية (MSC) وفقا للقواعد المحلية. إذا كان متوافقا مع النموذج البكتيري المستخدم ، كرر الخطوات من 1.4.1 إلى 1.4.4 لزيادة احتمالية الحصول على طفرات نسيلية. تتكون مكتبة الطافرة النموذجية (على الأقل) من عدد من الطفرات التي تساوي ثلاثة أضعاف عدد تسلسلات الترميز المشروحة في جينوم الكائن الحي المستخدم.

1. تحضير Coxiella RSA439 NMII ذو كفاءة كهربائية:
   1. تحضير 1x سيترات محمضة وسط -2 (ACCM-2): 13.4 ملي مولار حامض الستريك ، 16.1 ملي سترات الصوديوم ، 3.67 ملي فوسفات البوتاسيوم ، 1 ملي كلوريد المغنيسيوم ، 0.02 ملي كلوريد الكالسيوم ، 0.01 ملي كبريتات الحديد ، 125.4 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.5 ملي مولار ل-سيستين ، 0.1 جم / لتر باكتو نيوبيبتون ، 2.5 جم / لتر أحماض الكازامينو ، 1 جم / لتر ميثيل بيتا سيكلودكسترين ، 125 مل / لتر معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI). اضبط درجة الحموضة على 4.75 وقم بتعقيم الفلتر (لا تقم بالتعقيم).
      ملاحظه: السائل ACCM-2 مستقر عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد تقريبا.
   2. تلقيح 100 مل من ACCM-2 مع 2 × 10⁶ مكافئ الجينوم (GE) / مل من Coxiella RSA439 NMII (من مخزون بكتيري تم إنشاؤه مسبقا وتحديده كميا كما في الخطوة 1.5) من مخزون -80 درجة مئوية وتوزيع المعلق البكتيري في قوارير ثقافة خلية^مقاس 75 سم 2 بأغطية تهوية (10-15 مل من المعلق البكتيري لكل قارورة). تنمو لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂) و 2.5٪ أكسجين (O₂).
   3. قم بتجميع التعليق البكتيري الناتج في أنابيب سعة 50 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 3,900 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
   4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 30 مل من الجلسرين بنسبة 10٪. جهاز طرد مركزي عند 3,900 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
   5. أعد تعليق الحبيبات بحجم مناسب من 10٪ جلسرين (عادة 2 مل) و aliquot 50 ميكرولتر في 500 أنابيب ميكرولتر. احتفظ بالبكتيريا العالقة على الجليد أثناء العملية برمتها.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، تكون البكتيريا ذات كفاءة كهربائية وتكفي حصة واحدة لإجراء ثقب كهربائي واحد. يمكن تخزين المعلقات البكتيرية عند -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر أو استخدامها مباشرة للتثقيب الكهربائي للحمض النووي الريبي المنقوص للأكسجين (DNA).
2. التثقيب الكهربائي ل Coxiella المختصة مع البلازميدات المشفرة للينقولات والترانسبوزات:
   1. قم بتبريد كوفيت كهربائي مقاس 0.1 سم مسبقا لمدة 10 دقائق على الثلج. امزج 50 ميكرولتر من Coxiella ذات الكفاءة الكهربائية مع 10 ميكروغرام من بلازميد الينقولات و 10 ميكروغرام من بلازميد الترانسبوزاز. تأكد من أن تركيز البلازميد أعلى من 500 ميكروغرام / مل لتقليل تخفيف الجلسرين.
   2. التثقيب الكهربائي باستخدام الإعداد التالي: 18 كيلو فولت ، 500 Ω ، 25 ميكرو فهرنهايت. تأكد من أن ثابت الوقت الناتج يتكون بين 9 و 13 مللي ثانية.
   3. أضف على الفور 950 ميكرولتر من RPMI ، وأعد تعليق البكتيريا المثقلة بالكهرباء وانقلها إلى أنبوب غطاء لولبي واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة.
   4. خذ 200 ميكرولتر من البكتيريا المثقبة بالكهرباء وأضف 3 مل من ACCM-2 مع مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة بنسبة 1٪ (FBS) في أطباق مكونة من 6 آبار. أضف 88 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى الحجم المتبقي من البكتيريا المثقلة بالكهرباء (للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 10٪ DMSO) وتخزينها عند -80 درجة مئوية
      ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول التالي ، يتم تشفير العنصر القابل للنقل والترانسبوزاز بواسطة بلازميدين مختلفين (pITR-CAT-GFP و pUC19-Himar1C9 ، على التوالي). يفتقر كلا البلازميدات إلى أصل النسخ المتماثل الخاص ب Coxiella ، مما يجعلهما بلازميدات انتحارية عند تكوينها كهربائيا في Coxiella. هذا يضمن إدخالات مستقرة للينقولات. يحتوي العنصر القابل للنقل على كاسيت مقاومة الكلورامفينيكول بموجب تنظيم مروج Coxiella p1169 للاختيار وجين gfp بموجب تنظيم مروج Coxiella p311 لتمييز الطفرات المتولدة ب GFP.
3. اختيار طفرات الينقولات:
   1. احتضان الألواح المكونة من 6 آبار الملقحة كما هو موضح أعلاه (1.2.4) بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 2.5٪ O₂. أضف المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام/مل كاناميسين أو 3 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول). احتضان المزرعة البكتيرية لمدة 3 أيام إضافية في الظروف الموضحة أعلاه.
4. عزل المسوخ الفردي:
   1. تحضير ألواح ACCM-2 الصلبة وطلاء طفرات الينقولات Coxiella
      ملاحظه: التعليمات التالية مخصصة ل 1 طبق بتري ، يجب اختبار العديد من التخفيفات من الثقافات البكتيرية لتقييم حجم التلقيح الأمثل لعزل المستعمرة.
      1. سخني 10.5 مل من 0.5٪ agarose في الميكروويف واتركيها تبرد في حمام مائي 55 درجة مئوية. سخني 11.25 مل من 2x ACCM-2 (درجة الحموضة 4.75) عند 37 درجة مئوية.
      2. تحضير الاغاروز السفلي:
         1. اخلطي 10 مل من الاغاروز المذاب 0.5٪ مع 10 مل من 2x ACCM-2 وأضيفي المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام / مل كاناميسين أو 3 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول).
         2. تصب على الفور في طبق بتري. اترك طبق بتري مفتوحا ، واترك الوسط يبرد لمدة 30 دقيقة ، وجفف في الهواء لمدة 20 دقيقة.
      3. تحضير أعلى الاغاروز:
         1. امزج 1.25 مل من 2x ACCM-2 مع 0.75 مل من الماء في أنبوب بوليسترين سعة 5 مل ، أضف المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام / مل كاناميسين أو 3 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول) واحتضانه عند 37 درجة مئوية.
         2. أضف المزرعة البكتيرية (عادة من 1 إلى 100 ميكرولتر) والدوامة لمدة 5 ثوان.
         3. يضاف 0.5 مل من الاغاروز المذاب ويخلط ويسكب على الفور على قاع الاغاروز.
         4. اتركيه ليبرد لمدة 20 دقيقة ، واستبدل غطاء طبق بتري ، واحتضنه عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لتسهيل تصلب الاغاروز.
         5. يجف في الهواء لمدة 20 دقيقة بدون غطاء في MSC. تنمو الصفائح عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 2.5٪ O₂ لمدة 6 إلى 7 أيام.
   2. أضف DMSO إلى المزارع البكتيرية المتبقية للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 10٪ DMSO وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
   3. قم بتقييم التخفيف الأمثل على النحو التالي: تأكد من أن المستعمرات يبلغ قطرها من 0.5 إلى 1 مم ويتم عزلها بشكل صحيح لتجنب التلوث المتبادل. قم بإذابة المزارع البكتيرية المتبقية من النقطة 1.4.2 والصفيحة عند التخفيف المناسب على أجار ACCM-2 كما هو موضح في 1.4.1.2 و 1.4.1.3. احتضان لمدة 6 إلى 7 أيام كما هو موضح في 1.4.1.3.5.
   4. بمجرد أن يتم اكتشاف المستعمرات ، اجمعها عن طريق قطع نهاية طرف 1 مل ، واختيار السدادة التي تحتوي على مستعمرات معزولة ، وتفريق المستعمرة عن طريق سحب العينات في 1.5 مل من ACCM-2 التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (375 ميكروغرام / مل كاناميسين أو 3 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول) في صفيحة 24 بئرا. تضخيم المستعمرات الفردية لمدة 6 أيام في الظروف الموضحة في 1.3.1. في اليوم 3 من الحضانة ، قم بتفريق الكتل البكتيرية عن طريق سحب كل مزرعة.
   5. قم بتخزين كل تعليق متحور في أنابيب غطاء لولبي مشفرة ثنائية الأبعاد في ألواح 96 بئر بنسبة 10٪ DMSO عند -80 درجة مئوية.
5. تقييم تركيز البكتيريا:
   ملاحظه: يمكن تطبيق البروتوكول التالي للحصول على منحنيات نمو الطفرات البكتيرية التي تتكاثر في وسط محوري (انظر 1.4.4).
   1. إعداد المنحنى القياسي:
      1. قم بإعداد محلول مخزون 2 ميكروغرام / مل من الحمض النووي مزدوج الشريطة (dsDNA) (عادة ما يكون بلازميد عشوائي بحجم وتركيز معروفين) في 1x حمض Tris- ethylenediaminetetraacetic ، EDTA (TE). قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف من محلول المخزون للحصول على تركيزات تتراوح من 2 ميكروغرام / مل إلى 2 نانوغرام / مل. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من كل تركيز على آبار مفردة من صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا ذات جدران سوداء وقاع (انظر جدول المواد).
      2. قم بتخفيف كاشف الكمية dsDNA 1: 200 في 1x TE buffer وأضف 55 ميكرولتر من الكاشف المخفف إلى كل عينة في الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئر. تخلط جيدا باستخدام شاكر الألواح وتحتضن لمدة 2 إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام.
      3. قم بقياس تألق العينات باستخدام قارئ الألواح الدقيقة الفلورية والمرشحات للأطوال الموجية القياسية للفلورسين (الإثارة ~ 480 نانومتر ، الانبعاث ~ 520 نانومتر).
      4. ارسم نطاق تركيز البلازميد مقابل قراءات شدة التألق.
   2. القياس الكمي للتعليق البكتيري:
      1. قم بتوزيع 5 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 لكل بئر في صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا بجدران وقاع سوداء (انظر جدول المواد). أضف 50 ميكرولتر من المعلقات البكتيرية إلى كل بئر واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، على شاكر اللوحة.
      2. قم بتخفيف كاشف الكمية dsDNA 1: 200 في 1x TE buffer وأضف 55 ميكرولتر من الكاشف المخفف إلى كل عينة في الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئر. تخلط جيدا باستخدام شاكر الألواح وتحتضن لمدة 2 إلى 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام.
      3. قم بقياس تألق العينات باستخدام قارئ الألواح الدقيقة الفلورية والمرشحات للأطوال الموجية القياسية للفلورسين (الإثارة ~ 480 نانومتر ، الانبعاث ~ 520 نانومتر).
      4. للحصول على تركيز الحمض النووي البكتيري ، ارسم قراءات التألق في الرسم البياني الذي تم الحصول عليه عند النقطة 1.5.1.4. اقسم تركيز الحمض النووي على كتلة جينوم Coxiella (2.2 fg) للحصول على تركيزات بكتيرية. نتائج سريعة في مكافئ الجينوم / مل.
      5. تخلص من الطفرات التي تظهر عيبا كبيرا في النمو في ACCM-2.

< p class = "jove_title" >2. تفاعل البوليميراز المتسلسل لمستعمرة التمهيدي الفردي (PCR) ، والتسلسل ، والتعليق التوضيحي

ملاحظة: البروتوكول التالي مخصص لتضخيم الحمض النووي ل 96 عينة، يوصى باستخدام ماصة متعددة القنوات للخطوات التالية. يتم التعاقد من الباطن على تنقية العمود لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الخرز المغناطيسي وتسلسل الحمض النووي باستخدام برايمر خاص بالينقولات (2.3) إلى شركة خارجية.

1. تأكد من أن برايمر التضخيم مصمم من أجل تهجين ما بين 100 و 200 زوج أساسي في المنبع من التكرار الترادفي المقلوب (ITR) ، للحصول على منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تغطي موقع إدخال الينقولات على جينوم Coxiella. قم بإعداد 3 مل من مزيج PCR (1x عازلة عالية الدقة ، 200 ميكرومتر ثلاثي فوسفات ديوكسي نوكليوزيد (dNTPs) ، 1 ميكرومتر برايمر تضخيم ، 20 وحدة / مل بوليميراز DNA عالي الدقة) وتوزيع 29 ميكرولتر لكل بئر في لوحة PCR مكونة من 96 بئرا مثبتة على الجليد. انقل 1 ميكرولتر من كل طفرة في المرحلة الثابتة في ACCM-2 إلى مزيج PCR.
2. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع التمسخ الأولي (98 درجة مئوية، 1 دقيقة)، و20 دورة عالية الصرامة (98 درجة مئوية، 10 ثوان؛ 50 درجة مئوية، 30 ثانية؛ 72 درجة مئوية، 90 ثانية)، 30 دورة صرامة منخفضة (98 درجة مئوية، 10 ثوان؛ 30 درجة مئوية، 30 ثانية؛ 72 درجة مئوية، 90 ثانية) و30 دورة صرامة عالية (98 درجة مئوية، 10 ثوان؛ 50 درجة مئوية ، 30 ثانية ؛ 72 درجة مئوية ، 90 ثانية) متبوعا بتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
3. قم بتنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الخرز المغناطيسي وتسلسل الحمض النووي باستخدام برايمر خاص بالينقولات. صمم التمهيدي الخاص بالينقولات بدرجة حرارة انصهار متوقعة تتكون من 50 درجة مئوية و 75 درجة مئوية ، ومحتوى GC بين 40٪ و 60٪ ، وطول يتراوح بين 18 و 25 نيوكليوتيد ، وموقع تلدين في اتجاه مجرى موقع تهجين التمهيدي للتضخيم وما لا يقل عن 100 زوج أساسي في المنبع من الزوج الأساسي الأول من الينقولات ITR.
4. باستخدام برنامج تحليل التسلسل ، قم بتحميل الجينوم الكامل المشروح ل Coxiella burnetii 493 NMI. استخدم وظيفة "المحاذاة للمرجع" لتحميل ومحاذاة (تفجير) نتائج التسلسل وتحديد موقع التحويل. تجاهل المسوخ مع عدم المطابقة و / أو عرض قراءات مزدوجة. لمراقبة تشبع المكتبة الطافرة ، احتفظ بسجل لحدوث إدخالات متعددة للينقولات في نفس الموقع.

< p class = "jove_title" >3. تحدي الخلايا حقيقية النواة مع طفرات كوكسيلا ومراقبة النمو داخل الخلايا

ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة متعددة القنوات للخطوات التالية. تم إجراء العدوى في ثلاث نسخ في صفائح دقيقة معقمة مكونة من 96 بئرا بجدران سوداء وقيعان شفافة مسطحة. تم توفير الوزن مع Coxiella burnetii التي تعبر عن GFP من قبل الدكتور روبرت هاينزين.

1. تنمو خلايا Vero في RPMI بدون فينول أحمر مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) في حالة عدم وجود مضادات حيوية (وسائط RPMI كاملة).
2. في اليوم السابق للإصابة ، اغسل خلايا Vero من قارورة ثقافة الخلايا المتقاربة أو شبه المتجمعة ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. افصل خلايا Vero عن طريق إضافة 1 مل من محلول التربسين EDTA إلى قارورة زراعة الخلية واحتضانها لمدة 3 إلى 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
4. قم بإيقاف تشغيل الخلايا في 10 مل من وسائط RPMI الكاملة. عد الخلايا وإعداد معلق خلوي من 10⁵ خلايا لكل مل.
5. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة سوداء سعة 96 بئرا ذات قاع شفاف مسطح.
6. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لتسهيل التصاق الخلية في قاع الآبار واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
7. قم بإذابة الألواح المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على طفرات Coxiella عند RT وقم بتخفيف 150 ميكرولتر من المعلق البكتيري في 300 ميكرولتر من RPMI بدون فينول أحمر و FBS في صفيحة عميقة بئر 96 بئر.
8. قم بإزالة الوسائط من الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على خلايا Vero وقم بتوزيع 100 ميكرولتر / بئر من طفرات Coxiella المخففة (MOI من 100). استخدم جيدا A1 كتحكم سلبي (خلايا غير مصابة) والآبار A2 و A3 كعناصر تحكم إيجابية (الخلايا المصابة بالوزن Coxiella التي تعبر عن GFP في تعدد العدوى (MOI) من 100 و 200).
قم
9. بالطرد المركزي للوحة لمدة 10 دقائق عند 400 × جم عند RT باستخدام حامل لوحة طرد مركزي محكم الغلق.
10. احتضان عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة ساعتين ثم استبدل الوسط المحتوي على البكتيريا ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط RPMI الطازج الكامل.
11. قم بقياس مضان GFP كل يوم لمدة 7 أيام باستخدام قارئ صفيحة مضان ومرشحات للأطوال الموجية الفلوريسئية القياسية (الإثارة ~ 480 نانومتر ، الانبعاث ~ 520 نانومتر). لتجنب التداخل الناتج عن التكثيف وتشتت الإشارة في وسط الاستزراع، استخدم الإثارة السفلية وتسجيل البث على قارئ الصفيحة الدقيقة.

4. تحضير العينات للحصول على الصور الآلي

ملاحظة: الإجراء هو لوحة واحدة مكونة من 96 بئرا ، قم بتوسيع نطاق الأحجام وفقا لذلك. قد تستفيد الخطوات من 4.2 من غسالة الألواح.

1. في اليوم^السابع بعد الإصابة ، قم بإزالة الوسط من اللوحة واستبدله ب 50 ميكرولتر / بئر من الوسط الكامل الطازج الذي يحتوي على صبغة فلورية منفذة للخلية عند التخفيف المناسب (عادة 1: 1,000 ، ليتم تحسينها وفقا لخط الخلية المستخدم). احتضان الخلايا لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. استبدل الوسط ب 50 ميكرولتر / بئر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم قم بإزالة المخزن المؤقت المحتوي على PFA واغسله 3 مرات باستخدام PBS.
3. قم بإزالة PBS وتوزيع 50 ميكرولتر / بئر من محلول الحجب (0.5٪ ألبومين مصل بقري ، 50 ملي كلوريد الأمونيوم ، NH₄Cl في PBS ، درجة الحموضة 7.4) مكملة بنسبة 0.05٪ صابونين. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة.
4. استبدل محلول الحجب ب 40 ميكرولتر / بئر من محلول المنع الطازج المكمل بالصابونين (على النحو الوارد أعلاه) وبجسم مضاد للغشاء المرتبط بالليزوسوم بروتين سكري -1 (مضاد للأشعة 1) عند تخفيف 1: 500. احتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في RT.
5. قم بإزالة محلول الانسداد واغسل اللوحة المكونة من 96 بئر 5 مرات باستخدام 100 ميكرولتر / بئر من PBS.
6. قم بتوزيع 40 ميكرولتر / بئر من محلول الحجب المكمل بالصابونين (على النحو الوارد أعلاه) ، والجسم المضاد الثانوي المناسب المسمى بالفلورسنت (عند تخفيف 1: 1,000) للكشف عن الجسم المضاد المضاد ل LAMP1 المطبق في الخطوة 4.4 ، ومع Hoechst 33258 عند 5 ميكروغرام / مل. احتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في RT.
7. قم بإزالة محلول الانسداد واغسل اللوحة المكونة من 96 بئر 5 مرات باستخدام 100 ميكرولتر / بئر من PBS. اترك حجم PBS المقابل لآخر غسيل في اللوحة المكونة من 96 بئرا ، حيث يجب ألا تجف الخلايا الثابتة.
8. قم بتصوير اللوحة على الفور أو قم بتخزين اللوحة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء ، لتحليلها لاحقا.

5. الحصول على الصور

1. احصل على صور في GFP (488 نانومتر ، بكتيريا) ، Hoechst 33258 (350 نانومتر ، نوى الخلية المضيفة) ، الأحمر (~ 555 نانومتر ، علامة غشاء الخلية) ، والأحمر البعيد (~ 615 نانومتر ، LAMP1) باستخدام مجهر آلي متألق مزود بهدف 20X. الحصول على 21 حقلا مستقلا لكل بئر من أجل تصوير ما لا يقل عن 5,000 خلية لكل عينة. قم بتطبيق التركيز البؤري التلقائي باستخدام قناة نوى الخلية المضيفة كمرجع. عند العمل مع مسببات الأمراض البكتيرية التي تصيب نسبة منخفضة من الخلايا المضيفة ، يمكن للمستخدمين ضبط عدد الحقول المستقلة التي تم تصويرها في كل بئر ، من أجل الحصول على ما لا يقل عن 500 خلية مصابة لتحليلها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حامض الستريك سيغما C0759-500G مكون متوسط ACCM-2 سترات الصوديوم سيغما S4641-500G مكون متوسط ACCM-2 فوسفات البوتاسيوم سيغما 60218-100 جرام مكون متوسط ACCM-2 كلوريد المغنيسيوم سيغما M2670-100G مكون متوسط ACCM-2 كلوريد الكالسيوم سيغما سي 5080-500 جرام مكون متوسط ACCM-2 كبريتات الحديد سيغما F8633-250G مكون متوسط ACCM-2 كلوريد الصوديوم سيغما S9625-500G مكون متوسط ACCM-2 L-سيستين سيغما C6852-25G مكون متوسط ACCM-2 باكتو نيوبتون BD (بيكتون ديكنسون) 211681 مكون متوسط ACCM-2 أحماض الكازامينو BD (بيكتون ديكنسون) هاتف: 223050 مكون متوسط ACCM-2 ميثيل ب سيكلودكسترين سيغما سي 4555-10 جي مكون متوسط ACCM-2 RPMI مع جلوتاماكس جيبكو 61870-010 مكون متوسط ACCM-2 RPMI مع جلوتاماكس ، بدون أحمر الفينول جيبكو 32404-014 لزراعة الخلايا والعدوى مصل الأبقار الجنينية جنرال إلكتريك للرعاية الصحية SH30071 لزراعة الخلايا التربسين EDTA (0.25٪) تقنيات الحياة هاتف: 25200-056 لزراعة الخلايا سابونين سيغما 47036 لتلوين التألق المناعي كلوريد الأمونيوم سيغما أ 9434 لتلوين التألق المناعي ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 2153 لتلوين التألق المناعي كوفيت كهربائي 0.1 سم يوروجينتيك CE0001-50 لتحويل Coxiella زملاء المسار المسمار الأنابيب العلوية مع قبعات الترمو: العلمية 3741 2D الباركود اللولبي صفيحة دقيقة 96 بئر بجدران سوداء وقاع غرينر 655076 قاع مسطح مظلم ، لقياس كمية dsDNA 96 بئر صفيحة دقيقة ، جدران سوداء شفافة غرينر 655090 قاع شفاف مسطح ، لزراعة الخلايا والتصوير 96 بئر PCR microplate بيوراد 2239441 خال من DNAse / RNAse طبق 96 جيدا ، ديبويل لابكون 949481 لعدوى طفرات كوكسيلا بيكو جرين تقنيات الحياة P7581 لقياس كمية dsDNA تريتون X-100 سيغما T9284-500 مل لقياس كمية dsDNA Phusion عالية الدقة DNA polymerase نيو إنجلاند بيولابيس M0530L لمستعمرة التمهيدي المتسلسل الفردي Celltracker أحمر CMTPX تقنيات الحياة سي 34552 للتصوير الجسم المضاد المضاد ل LAMP1 سيغما 94403-1 مل لتلوين التألق المناعي هوشست 33258 سيغما L1418 للتصوير قارئ الألواح الدقيقة الفلورية Infinite 200 Pro تيكان المجهر الآلي Epifluorescence Cellomics الترمو: العلمية