مقايسة العدوى البكتيرية لدراسة تفاعلات البكتيريا اللاهوائية بين الخلايا المضيفة

الملخص

المصدر: Wunsch، C.M.، et al. Porphyromonas gingivalis ككائن حي نموذجي لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع الخلايا المضيفة. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تقنية لتقييم قدرة Porphyromonas gingivalis ، وهي بكتيريا مسببة للأمراض اللاهوائية ، على الالتصاق بالخلايا البطانية للأوردة السرية البشرية (HUVECs) وغزوها. بعد إصابة الخلايا المضيفة بالبكتيريا ، يتم تحلل الخلايا المضيفة لإطلاق كل من البكتيريا الملتصقة والداخلية عندما يتم طلاء المحللة في وسط مناسب ، فإن وجود المستعمرات يشير إلى تفاعلات الخلايا المضيفة البكتيرية الناجحة.

البروتوكول

ستصف البروتوكولات التالية طرق زراعة ودراسة غزو الأنواع اللاهوائية ، P. gingivalis ؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام هذه البروتوكولات لعدد من مسببات الأمراض اللاهوائية. على الرغم من استخدام HUVECs ، يمكن استخدام هذا البروتوكول للخلايا حقيقية النواة الأخرى المناعية وغير المناعية.

فئة

1. استخدام الغرفة اللاهوائية وصيانتها

ملاحظة: P. gingivalis هو لاهوائي حساس للمستويات الطبيعية من الأكسجين الذي يتم مواجهته في الهواء المحيط. تعتبر البيئة اللاهوائية الخاضعة للرقابة أمرا حيويا لزراعة P. gingivalis.

1. هنا ، حافظ على جو اصطناعي مخصص على أنه غاز لاهوائي مختلط (80٪ N₂ ، 10٪ H₂ ، 10٪ CO₂) في غرفة لاهوائية من الفينيل (الشكل 1 أ). استخدم غرفة معادلة الضغط (الشكل 1 ب) لنقل العناصر من بيئة المختبر إلى الغرفة اللاهوائية. يعمل غرفة معادلة الضغط يدويا ، ويتم تطهيره مرتين بغاز N₂ قبل إدخال الغاز اللاهوائي المختلط.
2. استخدم عمود إزالة كبريتيد الهيدروجين (الشكل 1 ج) لإزالة كبريتيد الهيدروجين غير المرغوب فيه بدون صيانة. ضع مزيل الرطوبة داخل الغرفة لإزالة H₂O الناتج عن المحفز ولتجنب الهباء الجوي الذي يسهل انتشار التلوث.
   ملاحظه: كبريتيد الهيدروجين هو منتج ثانوي استقلابي طبيعي للعديد من البكتيريا اللاهوائية وتراكمه سام للبكتيريا ويمكن أن يؤدي إلى تلف الإلكترونيات وتقليل عمر المحفز.
3. استخدم صندوق مروحة لتدوير الغلاف الجوي للغرفة من خلال محفز البلاديوم ، والذي يزيل الأكسجين في وجود الهيدروجين (الشكل 1 د).
   ملاحظة: يزيل مرشح الغلاف الجوي المعاد تدويره (هواء الجسيمات عالي الكفاءة أو HEPA) الملوثات المحمولة جوا بحجم 0.22 ميكرومتر أو أكبر.
4. زراعة البكتيريا اللاهوائية في حاضنة 37 درجة مئوية تقع داخل الغرفة اللاهوائية. استخدم تقنيات التعقيم القياسية عند العمل داخل الغرفة اللاهوائية.

< p class = "jove_title" >2. تحضير البكتيريا اللاهوائية

ملاحظة: P. gingivalis يتحمل الهواء ويمكن تخزينه في ظروف هوائية ولكنه لن ينمو في وجود الأكسجين عند مستويات أعلى من 6٪. الغرفة اللاهوائية ضرورية للزراعة المناسبة ل P. gingivalis والأنواع اللاهوائية الأخرى (الشكل 1). مطلوب التدريب والتعليم المناسبين حول استخدام الغرفة اللاهوائية قبل العمل مع اللاهوائية الدقيقة.

1. قم بموازنة جميع الوسائط والصفائح السائلة في الظروف اللاهوائية لمدة 12 ساعة على الأقل قبل التجربة لإزالة الأكسجين المتبقي.
2. انقل P. gingivalis من فريزر -80 درجة مئوية إلى غرفة لاهوائية ، واتركها تذوب.
3. Streak P. gingivalis على لوحات أجار دم الصويا تريبتكاز (TSA II مع 5٪ دم الأغنام). لف الأطباق في بارافيلم وخزنها على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة لاهوائية لمدة 4-7 أيام.
4. تلقيح P. gingivalis في مرق 3 مل من تسريب القلب في الدماغ (BHI) مكمل بالهيمين والميناديون ، وهو وسط سائل غير انتقائي غني لعزل واستزراع الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية والحساسة ، باستخدام حلقات معقمة.
   ملاحظه: للتخزين طويل الأجل ، اخلطي المزارع البكتيرية المحضرة في BHI مع الجلسرين أو DMSO (التركيز النهائي 10-20٪) وضعيها في فريزر -80 درجة مئوية.
5. قم بإعداد مزرعة بداية من P. gingivalis عن طريق التخفيف بنسبة 1:10 والسماح للبكتيريا بالنمو حتى منتصف مرحلة السجل.

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتم تحديد الكثافة البصرية للتعليق البكتيري ويتم ضبط التركيز البكتيري لكل سلالة سيتم فحصها. بالنسبة إلى P. gingivalis ، يتوافق معلق في OD₆₆₀ من 0.7 مع مرحلة منتصف السجل و ~ 7 × 10⁸ خلايا / مل. ظروف النمو الموضحة في البروتوكول أعلاه خاصة بالمتصورة اللثوية وقد تحتاج إلى تكييفها مع السلالات البكتيرية الأخرى.

< p class = "jove_title" >3. ثقافة الخلايا البطانية

ملاحظة: قم بشراء HUVECs الأولية المجمعة والمزرعة في وسط قاعدي يحتوي على عوامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بذور
1. HUVECs في قوارير T-75 بحجم 2.5 × 10⁵ خلايا / قارورة في وسائط VEGF سعة 15 مل.
   ملاحظه: تحقق من الجدوى من خلال التخفيف بنسبة 1: 1 مع 4.0٪ تريبان بلو. ستحتفظ الخلايا ذات الغشاء المخترق باللون الأزرق ، وستظهر الخلايا السليمة ذات الأغشية السليمة باللون الأبيض عند عرضها تحت المجهر الضوئي المجهري. عد 100 خلية ، وتأكد من أن أكثر من 80٪ من الخلايا قابلة للحياة.
2. استبدل الوسائط كل يومين بوسائط VEGF جديدة مسخنة مسبقا حتى تصل الخلايا إلى ~ 80٪ من التقاء.
3. اغسل الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) المسخن مسبقا. حرر الخلايا من قارورة T75 عن طريق الحضانة ب 2 مل من التربسين EDTA (0.25٪) لمدة 5 دقائق متبوعا بمحلول تحييد التربسين 2 مل.
4. اجمع HUVECs المعلقة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اغسل أي خلايا إضافية من قوارير T-75 باستخدام PBS وانقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
5. خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق.
6. قم بإزالة المادة الطافية ، وقم بتعليق حبيبات الخلية في وسائط VEGF الدافئة مسبقا سعة 10 مل.
7. حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم أو جهاز عد الخلايا المماثل.
8. احسب كمية تعليق الخلية المراد إضافتها إلى صفيحة ذات 6 آبار (400,000 / بئر) أو صفيحة 12 بئرا مع أغطية (50,000 / بئر). ستكون HUVECs جاهزة للتجريب في اليوم التالي.

< p class = "jove_title" >4. غزو / تفاعل فحص البقاء على قيد الحياة (الطلاء)

< p class = "jove_content">ملاحظة: عند إجراء هذا الاختبار ، قم بإعداد لوحين من 6 آبار من الخلايا البطانية المزروعة في 400,000 خلية / بئر. سيتم استخدام لوحة واحدة لتقييم البكتيريا المرتبطة بالخلايا المضيفة واستيعابها. اللوحة الأخرى ستمثل البكتيريا داخل الخلايا. تسمح اللوحة المكونة من 6 آبار بإجراء ثلاث نسخ من عينتين في تجربة واحدة. للحصول على مخطط تفصيلي لهذا البروتوكول ، يرجى الرجوع إلى المخطط الانسيابي لمقايسة البقاء على قيد الحياة (الشكل 2).

1. تحضير البكتيريا اللاهوائية كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 1) حتى تصل إلى منتصف نمو السجل (OD₆₆₀ 0.5-0.7).
2. بكتيريا الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 10 دقائق < br / > ملاحظة: إذا كان جهاز الطرد المركزي خارج غرفة لاهوائية ، فحمل عينات بكتيرية في أنبوب مغلق بإحكام سعة 15 مل ، ولف الغطاء بالبارافيلم لمنع تسرب الأكسجين.
3. ضع P. gingivalis المحبب مرة أخرى في الغرفة ، وتخلص من المادة الطاففية. اغسل باستخدام PBS وبكتيريا الحبيبات مرة أخرى قبل التعليق في وسائط VEGF. قم بإعداد المعلقات لجميع السلالات البكتيرية ليتم اختبارها عند OD₆₆₀ من 0.7 والتي تتوافق مع مرحلة منتصف السجل (~ 7 × 10⁸ خلايا / مل). البكتيريا جاهزة الآن للعدوى.
4. انقل الألواح المكونة من 6 آبار التي تحتوي على HUVECs من حاضنة زراعة الأنسجة إلى الغرفة اللاهوائية. قم بإزالة الوسائط واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS اللاهوائية. أضف 2 مل من وسائط VEGF اللاهوائية إلى كل بئر وضع الألواح عند 37 درجة مئوية في الحاضنة اللاهوائية لمدة 20 دقيقة لموازنة درجة حرارة العدوى.
   ملاحظه: صفيحة البكتيريا على ألواح أجار الدم للتأكد من أن تلك المستخدمة في العدوى متجانسة وغير ملوثة عند الإصابة.
5. تصيب الخلايا المضيفة بالبكتيريا في تعدد العدوى (بكتيريا وزارة الداخلية: المضيف) 100: 1.
   ملاحظه: يتم تحديد عدد خلايا HUVEC عن طريق إجراء اختبار استبعاد الtrypan على بئر واحد قبل الإصابة. يتم تحديد عدد الخلايا البكتيرية عن طريق الكثافة الضوئية (على سبيل المثال ، OD 0.5 = 5 × 10⁸ خلايا / مل). يتم ضبط تركيز البكتيريا إلى وزارة الداخلية المناسبة بناء على تركيز HUVEC.
6. ضع أطباق مكونة من 6 آبار تحتوي على HUVECs المصابة في الحاضنة اللاهوائية واسمح للبكتيريا بالتفاعل مع الخلايا المضيفة لمدة 30 دقيقة.
7. تحضير الصابونين في BHI (1.0٪ وزن / حجم) داخل الغرفة اللاهوائية وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
8. بقاء كل من البكتيريا المرتبطة والداخلية على قيد الحياة.
   1. قم بإزالة الأطباق من الحاضنة ، وشفط الوسائط ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS اللاهوائي ، وأضف 2 مل من الصابونين المصفى بنسبة 1.0٪ (محضر كما هو موضح في الخطوة 4.8). احتضان لمدة 15 دقيقة للسماح بتحلل الخلية المضيفة.
   2. اكشط قاع كل بئر باستخدام مكشطة خلوية. اجمع خليط الخلية من كل بئر وقم بعمل تخفيف 1: 1 في BHI.
   3. تابع عمل تخفيفات متسلسلة للعينة. اعتمادا على الأنواع البكتيرية وتركيزها ، اضبط التخفيفات التسلسلية. ابدأ ب 1: 100 أو 1: 1,000 مخففات.
   4. صفيحة 200 ميكرولتر من التخفيف المطلوب على ألواح أجار الدم. لف الألواح في البارافيلم وضعها في الحاضنة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية.
   5. بعد سبعة أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة الألواح وعد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) باستخدام صندوق ضوئي لحساب المستعمرات يدويا.
      ملاحظه: يتم تعداد CFUs. بالنسبة لكميات أكبر من وحدات التمويل المكبرة ، يمكن التقاط الصور ويمكن استخدام برامج الكمبيوتر لتسهيل تعداد وحدات التشكيل المالي.

النتائج

الشكل 1. غرفة الفينيل اللاهوائية ومكوناتها. (أ) توفر غرفة اللاهوائية المصنوعة من الفينيل المختومة تماما من الأكسجين الجوي مساحة عمل لشخصين في وقت واحد (32 بوصة × 78 بوصة). يحتوي على حاضنة مثبتة عند 37 درجة مئوية (الوسط الخلفي). (ب) يتم استخدام غرفة معادلة الضغط لنقل العناصر من بيئة المختبر إلى الغرفة اللاهوائية. في الصورة غرفة معادلة الضغط التلقائية يتم تشغيلها من خل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات غرفة الفينيل اللاهوائية من النوع B منتجات مختبر كوي حاضنة موديل 2000 TSA II Trypticase Soy Agar مع 5٪ دم الأغنام تكبير الأرصاد 221261 الخلايا البطانية للوريد السري البشري تجمع 10 مانحين تقنية شريان الحياة إف سي-0044 مجموعة VascuLife VEGF المتوسطة الكاملة تقنية شريان الحياة ل ل -0003 تريب كيت شريان الحياه ل إم -0013 سابونين ريدل دي هاين 16109