$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. استيعاب البكتيريا في الخلايا المضيفة (الفحص المجهري الفلوري)
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: P. gingivalis تم تصنيفه ب 2',7'-مكرر-(2-كربوكسي إيثيل) -5-(و-6)-كربوكسي فلورسين, أسيتوكسي ميثيل استر (BCECF-AM). BCECF-AM هي صبغة غير فلورية نفاذة للغشاء ؛ يمكن أن يشير تحويله إلى فلورسين BCECF عن طريق عمل الاستيرازات داخل الخلايا إلى قابلية الخلية للحياة.
P. gingivalis يتم تصنيفه بصبغة BCECF-AM ثم يستخدم لإصابة الخلايا حقيقية النواة. بعد الإصابة ، يتم تثبيت الخلايا وتصنيفها ب DAPI و TRITC-phalloidin. ستعمل صبغة DAPI المستخدمة في تلطيخ نواة الخلية حقيقية النواة أيضا على تسمية نواة الخلية البكتيرية ، مما يوفر تدبيرا مضادا لتحديد البكتيريا غير القابلة للحياة التي لا تستطيع شق BCECF-AM الأيضية. يتم تمييز الخلايا المضيفة باستخدام TRITC-phalloidin ، وهي صبغة أكتين حمراء.
- أغطية الأوتوكلاف. أضف أغطية معقمة إلى ألواح ذات 12 بئرا قبل بذر الخلايا البطانية في 5 × 104 خلايا / بئر. (أعد اليوم قبل التجربة)
- قم بإعداد الخلايا البطانية على أغطية دائرية مقاس 18 مم (#1.5 سمك) في ألواح ذات 12 بئرا كما هو موضح أعلاه.
- تحضير البكتيريا اللاهوائية المزروعة إلى مرحلة منتصف السجل (OD660 = 0.5-0.7).
- اغسل البكتيريا 2x باستخدام PBS اللاهوائي عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جم وتعليق الحبيبات في PBS عند 5-7 × 108 خلايا / مل.
- أضف 20 ميكرولتر من 0.2 ملي من BCECF-AM إلى 2 مل من المعلق البكتيري (5-7 × 108 خلايا / مل) إلى التركيز النهائي ل BCECF-AM البالغ 2 ميكرومتر.
- احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
- لوحات نقل مع خلايا بطانية بذرة على 18 مم (# 1.5 سمك) أغطية دائرية من حاضنة زراعة الأنسجة إلى الغرفة اللاهوائية. يغسل باستخدام PBS ويتبادل بوسائط VEGF اللاهوائية.
ملاحظة: تحقق من أن HUVECs سليمة تحت المجهر الضوئي. يجب أن تكون HUVECS ~ 80٪ ملتصقة ، ويجب أن تكون التشكل قابلة للمقارنة مع الشركات المصنعة.
أجهزة - الطرد المركزي تحمل علامة البكتيريا عند 5,000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة صبغة BCECF-AM المتبقية. في وسائط VEGF اللاهوائية سعة 2 مل.
- إصابة الخلايا المضيفة بالبكتيريا المصنفة في وزارة الداخلية 100: 1 (البكتيريا: المضيف).
- احتضن في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد الإصابة ، اغسل الخلايا ب PBS ثلاث مرات وثبته في 4.0٪ بارافورمالدهيد طازج لمدة 10 دقائق < / >
ملاحظه: بعد تثبيت الخلايا ، يمكن إجراء التجارب خارج الغرفة اللاهوائية.
- اغسل أغطية مع PBS ثلاث مرات.
- أضف 1 مل من 0.2٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق.
- اغسل أغطية مع PBS ثلاث مرات.
- أضف 50 ميكرولتر من TRITC phalloidin (50 ميكروغرام / مل) إلى الغطاء لمدة 45 دقيقة.
- اغسل الغطاء ثلاث مرات ، ثم أخرجه من اللوحة المكونة من 12 بئرا وضعه على شريحة مع وسيط تثبيت ناعم يحتوي على DAPI. ختم الجوانب بطلاء الأظافر.
ملاحظه: يمكن تخزين الشرائح لبضعة أشهر في الظلام. تجنب التعرض للضوء لمنع التبييض الضوئي.
- عرض الشرائح باستخدام مجهر متحد البؤر.
- هنا ، استخدم نظاما طيفيا من 34 قناة (كاشف مصفوفة من 32 قناة وكاشفين جانبيين ل PMT ، بالإضافة إلى كاشف الضوء المرسل) تم تكوينه حول حامل AxioObserver (مقلوب) مع مرحلة XY آلية. يحتوي النظام على خمسة ليزر: الصمام الثنائي الأزرق (405 نانومتر) ، الأرجون متعدد الخطوط (458 ، 488 ، 514 نانومتر) ، الصمام الثنائي الأخضر (561 نانومتر) ، HeNe الأحمر (633 نانومتر) وليزر نبضي 440 نانومتر. تجهيز نظام التصوير مدى الحياة الفلورية بكاشفين هجينين من GaAsP (ل FRET-FLIM).
- اكتشف التألق من DAPI و TRITC في قناة واحدة باستخدام مرشح مزدوج النطاق بأطوال موجية للإثارة تبلغ 340-380 نانومتر و 540-560 نانومتر ، ومرشح انبعاث 435-485 نانومتر و 570-590 نانومتر على التوالي. اكتشف التألق من BCECF-AM باستخدام مرشح بطول موجي للإثارة يتراوح 440-500 نانومتر ومرشح انبعاث 510-590 نانومتر
ملاحظه: يجب إجراء ضوابط ل BCECF-AM على كل سلالة بكتيرية تتم دراستها لضمان وضع العلامات المناسبة على البكتيريا القابلة للحياة. تحقق أولا من أن البكتيريا غير القابلة للحياة إيجابية DAPI وسالبة BCECF. ثانيا ، تأكد من أن البكتيريا الحية يمكنها استقلاب BCECF-AM إلى فلورسين BCECF. قد تحتاج التركيزات المتغيرة للبكتيريا أو صبغة BCECF-AM إلى الاختبار للحصول على الملصقات المثلى.