تقييم نشاط قتل الخلايا الفقية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Paschall ، A. V. et al. ، فحص القتل opsonophelcytic لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية.J. Vis. Exp.(2019)

يظهر الفيديو مقايسة قتل البلعمة البصرية في المختبر باستخدام ثقافة مشتركة للعدلات البشرية مع المكورات العقدية الرئوية. تسهل الأجسام المضادة والبروتينات التكميلية تسيير البكتيريا ، مما يمكن العدلات من التعرف على البكتيريا وقتلها ، مما يدل على نشاط ناجح للعدلات البلعمة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. ثقافة خلايا HL-60 وتمايزها والتحقق من صحتها

1. تحضير وسائط زراعة الخلايا HL-60 المكونة من 500 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) مع L-glutamine و 50 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة. لا تضيف المضادات الحيوية لأن ذلك قد يؤثر على تمايز خلايا HL-60.
2. لتكاثر / صيانة خلايا HL-60 ، استزراع 5 × 10⁶ خلايا في 10 مل من وسائط زراعة الخلايا HL-60 في 75 سم² قوارير ذات فتحات تهوية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO₂). مرور الخلايا كل 3-4 أيام للحفاظ على تركيزات الخلايا المثلى.
   ملاحظه: يجب ألا يتجاوز تركيز الخلية 5 × 10⁶ / مل.
3. قم بتوليد مخزونات عاملة من خلايا HL-60 عن طريق نقل ما يقرب من 1 × 10⁶ خلايا / مل في وسائط زراعة HL60 مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في 1 مل أنابيب مبردة.
   ملاحظه: يمكن تخزين مخزون العمل عند -80 درجة مئوية. يجب تخزين المخزون الرئيسي عند -120 درجة مئوية.
4. قم بتمييز خلايا HL-60 عن طريق زراعة 1.5 × 10⁷ خلايا في 15 مل من وسائط زراعة الخلايا HL-60 مع 0.6٪ N و N-dimethylformamide (DMF) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في قوارير معقمة مقاس 75 سم² لمدة 3 أيام قبل نشاط القتل البلعمي (OPKA).
5. تحقق من أن خلايا HL-60 قد تم تمييزها بنجاح وأنها مناسبة للاستخدام في اختبار OPKA من خلال اختبار الجدوى وعلامات سطح الخلية وفقا لبروتوكولات قياس التدفق الخلوي المعمول بها. بعد التمايز ، قم بحصاد خلايا HL-60 وصمة لطيخ ما يقرب من 1 × 10⁴ خلايا بأجسام مضادة / بقع مترافقة بالفلورسنت ل CD71 و CD35 و annexin V و propidium iodide.
   ملاحظه: يجب أن تكون الخلايا المتمايزة ≥65٪ قابلة للحياة ، و ≥55٪ CD35 ⁺ ، و ≤20٪ CD71 ⁺ على النحو المحدد من خلال بروتوكولات التحقق المعمول بها (الشكل 1).

2. تحضير المخازن المؤقتة والكواشف OPKA

1. تحضير 50 مل من المخزن المؤقت المعقم B (OBB) عن طريق خلط 42.5 مل من محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) مع Ca^{2 + /} Mg²⁺ ، و 5 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة ، و 2.5 مل من الجيلاتين المعقم 0.1٪. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. احصل على مكمل أرنب صغير وخزنه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
3. الحصول على أو إعداد ألواح الاستزراع البكتيرية (أي 15 × 100 مم² 5٪ صفائح أجار دم الأغنام).

< p class = "jove_title" >3. تحضير عينات المخزون البكتيري

1. احصل على مخزون من السلالة (السلالات) البكتيرية المراد اختبارها.
   ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم استخدام النمط المصلي 3 Streptococcus pneumoniae (WU2 ، الذي قدمه الدكتور مون نهم بسخاء).
2. قم بزراعة السلالة البكتيرية في مرق مناسب (على سبيل المثال ، مرق تود هيويت + 0.5٪ مستخلص خميرة لسلالة WU2 هذه) لمدة 2-4 ساعة تقريبا عند 37 درجة مئوية < br / > ملاحظه: يجب أن تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) للثقافة بين 0.6 و 0.8.
3. حبيبات البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 6,000 × جم لمدة دقيقتين وإعادة تعليق الخلايا في 10-30 مل من 15٪ جلسرين في المرق المناسب. Aliquot المزرعة البكتيرية (500 ميكرولتر لكل حصة) في أنابيب طرد مركزي معقمة 1.5 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
4. قم بإذابة قارورة واحدة من المخزون البكتيري في حمام مائي 37 درجة مئوية. حبيبات الخلايا البكتيرية وإعادة تعليقها في 500 ميكرولتر من OBB في ظروف معقمة.
5. قم بإعداد تخفيفات مختلفة من المخزون البكتيري في OBB (أي 10 ميكرولتر بدون تخفيف ، 10 ميكرولتر من 1:10 ، 10 ميكرولتر من 1: 100 ، إلخ). قم بإجراء اختبار OPKA (الأقسام 4-6 ، بما في ذلك HL-60 / الزراعة المشتركة التكميلية) كما هو موضح أدناه باستخدام تخفيفات مختلفة من المخزون البكتيري غير المعالج. استزراع الصفائح طوال الليل عند 30 درجة مئوية (بدون_{ثاني أكسيد الكربون 2}).
   ملاحظه: درجة حرارة 30 درجة مئوية خاصة ب WU2 لمنع فرط النمو ؛ قد تنمو السلالات / الأنماط المصلية الأخرى على النحو الأمثل عند 37 درجة مئوية.
6. عد المستعمرات لكل تخفيف من المخزون البكتيري غير المعالج المزروع بشكل مشترك مع خلايا HL-60 والمكملة. تحديد التخفيف من البكتيريا ينتج عن العدد الأمثل من المستعمرات القابلة للعد (حوالي 80-120 وحدة تشكيل مستعمرة (CFUs) للبكتيريا غير المعالجة المزروعة مع خلايا HL-60). لاحظ هذا التخفيف ل OPKAs المستقبلية التي تنطوي على هذا المخزون البكتيري.

< ص الفئة = "jove_title" >4. العلاج البكتيري والثقافة

1. قم بإذابة أنبوب واحد من المخزون البكتيري المحضر في الخطوة 3.3. بكتيريا الحبيبات (6,000 × جم لمدة 2 دقيقة) وإعادة تعليق حبيبات الخلية في OBB عند التخفيف الأمثل كما هو محدد في الخطوة 3.6.
2. الماصة 10 ميكرولتر من التخفيف البكتيري المعلق لكل بئر في صفيحة استزراع الخلايا ذات القاع الدائري المكونة من 96 بئر.
3. أضف 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة المناسبة أو العلاج الدوائي إلى كل بئر تجريبي في نسختين.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تتم إضافة جسم مضاد خاص بالنمط المصلي تم إنشاؤه في الفئران كعلاج X ، ويضاف إنزيم هيدرولاز جليكوسيد معروف بتحلل كبسولة عديد السكاريد من النمط المصلي 3 كعلاج Y (الشكل 2). بالنسبة لآبار التحكم ، استخدم 1x PBS أو OBB ، اعتمادا على المخزن المؤقت المستخدم لآبار المعالجة.
4. رج لوحة العينة عند حوالي 90 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اضبط هذه الظروف اعتمادا على درجة الحرارة المثلى أو ظروف الاهتزاز للعلاجات التي يتم اختبارها.

فئة < p = "jove_title" >5. HL-60 الزراعة المشتركة البكتيرية

1. قم بإعداد خلايا HL-60 عن طريق حصاد الخلايا المتمايزة HL-60 التي تمت معالجتها ب DMF قبل ثلاثة أيام (انظر الخطوة 1.4) في أنابيب مخروطية سعة 15 مل. حبيبات الخلايا (500 × جم ، 3 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسلها بما لا يقل عن 10 مل من 1x PBS.
2. قم بتكسير الخلايا المغسولة (500 × جم ، 3 دقائق) ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في OBB (ابدأ ب 1 مل OBB واضبط التركيز النهائي 1 × 10⁷ / مل بعد عد الخلايا).
3. أضف مكمل الأرانب الصغيرة (مصل أرنب صغير معقم وغير مخفف ، من 3 إلى 4 أسابيع) بحجم نهائي 1: 5.
   ملاحظه: يجب أن يكون التركيز النهائي للخليط المكمل HL-60 1 × 10⁷ / مل. في حالة اختبار الاعتماد على المكمل ، يمكن استخدام محلول ثان يحتوي على خلايا HL-60 النشطة مع مكمل معطل بالحرارة (يمكن تعطيل المكمل عن طريق الحضانة في حمام مائي عند >55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل).
4. بعد اكتمال الاستزراع البكتيري لمدة ساعة واحدة (الخطوة 4.4) ، قسم كل عينة (أي 10 ميكرولتر من كل عينة 30 ميكرولتر جيدا إلى بئرين جديدين) إلى آبار مكررة لمجموعتين (أي استخدام 20 ميكرولتر فقط من الاستزراع المشترك الأصلي 30 ميكرولتر لحساب خطأ سحب العينات): سيتم استزراع مجموعة واحدة مع مكمل HL-60 وواحدة تشمل البكتيريا فقط. أضف 50 ميكرولتر من خليط HL-60-Complement (من الخطوة 5.3) إلى كل مجموعة تجريبية من الآبار (مفوضة + HL-60) ؛ أضف 50 ميكرولتر من OBB وحده إلى آبار البكتيريا فقط (المفوضة -HL-60).
   ملاحظه: على سبيل المثال ، يتم استخدام ما يقرب من 800 CFUs البكتيرية للزراعة المشتركة الأولية مع 5 × 10⁵/50 ميكرولتر خلايا HL-60. إذا كان هذا التعدد في العدوى مرتفعا جدا أو منخفضا جدا كما هو موضح في أرقام المستعمرات النهائية ، فاضبط التخفيف البكتيري الأولي بدلا من عدد خلايا HL-60.
5. رج اللوحة المكونة من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة (بدون ثاني أكسيد الكربون₂).

< p class = "jove_title" >6. طلاء العينة والحضانة بين عشية وضحاها

1. خفف كل بئر 1: 5 باستخدام OBB ، بحيث يكون حجم كل عينة لا يقل عن 50 ميكرولتر.
2. الماصة 50 ميكرولتر من كل عينة مباشرة على منطقة معينة من صفيحة الاستزراع البكتيرية ، مما يضمن التباعد الكافي بين العينات. بالنسبة لألواح أجار مستديرة مقاس 15 × 100 مم² ، قم بسحب ما يقرب من 4 عينات على لوحة واحدة.
3. قم بتغطيته واتركه حتى تجف لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
4. اقلب الألواح والثقافة طوال الليل عند 30 درجة مئوية (بدون_{ثاني أكسيد الكربون 2}). بدلا من ذلك ، يتم زراعة الصفائح في الجرار اللاهوائية لاختبار ما إذا كانت ظروف نقص الأكسجين تؤثر على نمو البكتيريا أو للتحكم في التشكل.
5. بعد الاستزراع بين عشية وضحاها ، عد المستعمرات في كل منطقة عينة محددة. قم بتحليل البيانات من خلال مقارنة عدد الخلايا الحية في كل مجموعة بالتحكم و / أو العينات المقابلة التي لا تتلقى الزراعة المشتركة لخلايا HL-60 (مما يدل على بقاء الخلية بنسبة 100٪ ، وقتل الخلايا بنسبة 0٪).

النتائج

الشكل 1: التحقق من صحة تمايز خلايا HL-60 عن طريق قياس التدفق الخلوي.تم حصاد خلايا HL-60 المتمايزة وغسلها وإعادة تعليقها في 1 × 10⁵ خلايا / مل PBS. ثم تم تقسيم الخلايا إلى 12 بئرا (100 ميكرولتر / بئر) في صفيحة من 96 بئرا. ثم تم تلطيخ الخلايا بمضاد CD35 المترافق بالفلورسنت ، ومضاد CD71 ، والملحق V ، ويوديد البروبيديوم. تم استخدام الخلايا غير الملوثة أو الخلايا الملطخة بأجسام مضادة من النمط ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المرفق الخامس (APC مقارن) بيو ليجند 640919 مضاد ل CD35 ، بشري (PE مترافق) بيو ليجند 333405 مضاد ل CD71 ، بشري (PE مترافق) بيو ليجند 334105 السلالة البكتيرية المراد استخدامها (مثل المكورات العقدية الرئوية ، WU2) المختبر المرجعي للجهاز التنفسي البكتيري (د. مون نهم) لوحات أجار الدم هاردي ديزاينگىس أ 10 مصل استنساخ الجنين HyClone SH30080.03 الجلسرين سيغما G9012-1L خلايا HL-60 ATCC CCL-240 التحكم في النمط المتنظير IgG (PE مترافق) بيو ليجند 400907 N ، N-dimethylformamide (DMF) فيشر للكيماويات م 2265 يوديد البروبيديوم سيغما ص 4864 وسائط RPMI مع L-glutamine كورنينج 10-040-السيرة الذاتية