تقييم البورفيروموناس اللثة الداخلية في الخلايا البطانية المضيفة

الملخص

المصدر: Wunsch ، C. M. ، et al. Porphyromonas gingivalis ككائن حي نموذجي لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع الخلايا المضيفة. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح اختبارا لتقييم بقاء Porphyromonas gingivalis داخل الخلايا البطانية البشرية. يتم تقييم مقياس البقاء على قيد الحياة ونمو Porphyromonas gingivalis الداخلي من خلال عدد المستعمرات الموجودة على صفيحة أجار الدم.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. بقاء البكتيريا الداخلية.

1. تحضير P. gingivalis البكتيريا اللاهوائية حتى تصل إلى منتصف نمو السجل (OD₆₆₀ 0.5-0.7).
2. بكتيريا الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 10 دقائق.
3. ضع P. gingivalis المحبب مرة أخرى في الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية. اغسل باستخدام PBS وبكتيريا الحبيبات مرة أخرى قبل التعليق في وسائط VEGF. قم بإعداد المعلقات لجميع السلالات البكتيرية ليتم اختبارها عند OD₆₆₀ من 0.7 والتي تتوافق مع مرحلة منتصف السجل (~ 7 × 10⁸ خلايا / مل). البكتيريا جاهزة الآن للعدوى.
4. انقل الألواح المكونة من 6 آبار التي تحتوي على HUVECs من حاضنة زراعة الأنسجة إلى الغرفة اللاهوائية. قم بإزالة الوسائط واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS اللاهوائية. أضف 2 مل من وسائط VEGF اللاهوائية إلى كل بئر وضع الألواح عند 37 درجة مئوية في الحاضنة اللاهوائية لمدة 20 دقيقة لموازنة درجة حرارة العدوى.
5. تصيب الخلايا المضيفة بالبكتيريا في تعدد العدوى (بكتيريا وزارة الداخلية: المضيف) 100: 1.
   ملاحظه: يتم تحديد عدد خلايا HUVEC عن طريق إجراء اختبار استبعاد الtrypan على بئر واحد قبل الإصابة. يتم تحديد عدد الخلايا البكتيرية عن طريق الكثافة الضوئية (على سبيل المثال ، OD 0.5 = 5 × 10⁸ خلايا / مل). يتم ضبط تركيز البكتيريا إلى وزارة الداخلية المناسبة بناء على تركيز HUVEC.
6. ضع أطباق مكونة من 6 آبار تحتوي على HUVECs المصابة في حاضنة لاهوائية واسمح للبكتيريا بالتفاعل مع الخلايا المضيفة لمدة 30 دقيقة.
7. تحضير الصابونين في BHI (1.0٪ وزن / حجم) داخل الغرفة اللاهوائية وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
8. قم بإزالة الأطباق من الحاضنة. يغسل ثلاث مرات باستخدام PBS اللاهوائي ويضاف 2 مل من وسائط VEGF مع المضادات الحيوية المكملة (300 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين و 400 ميكروغرام / مل من الميترونيدازول).
9. احتضن لمدة 1 ساعة. تأكد من اختبار المضادات الحيوية بحيث تكون فعالة بنسبة 100٪ في قتل السلالة البكتيرية المرغوبة وتأكد من أنها لا تخترق الخلايا المضيفة.
10. وسائط الشفط ، أضف 2 مل من الصابونين المصفى بنسبة 1.0٪. احتضان لمدة 15 دقيقة للسماح بتحلل الخلية المضيفة.
11. اكشط قاع كل بئر باستخدام مكشطة خلوية. اجمع خليط الخلية من كل بئر وقم بعمل تخفيف 1: 1 في BHI.
12. قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للعينة (1: 100 ، 1: 1،000).
13. صفيحة 200 ميكرولتر من التخفيف المطلوب على ألواح أجار الدم. لف الأطباق في بارافيلم وضعها في حاضنة لاهوائية.
14. بعد سبعة أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة اللوحات وحساب CFUs.

المواد