تقنية لتقييم توطين الأجسام المضادة الخاصة بالورم في الجسم الحي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Shivange، G.، et al. تحليل توزيع الورم والأنسجة للأجسام المضادة العلاجية الخاصة بالمستضد المستهدف. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تقنية لدراسة التوطين في الجسم الحي للأجسام المضادة الخاصة بالورم في نموذج الطعم الغريب لورم الفأر. عند حقن الخلايا السرطانية تحت الجلد في الفئران لتكوين الورم ، يتم حقن الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية التي ترتبط بالمستقبلات الخاصة بالورم ، مما يتيح التقييم في الجسم الحي لتوطين الأجسام المضادة عن طريق التصوير.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. التعبير عن الأجسام المضادة وتنقيتها

1. صيانة خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO)
   1. قم بزراعة خلايا CHO في FreeStyle CHO Media مع مكمل الجلوتامين 1x المتاح تجاريا عند 37 درجة مئوية يهتز عند 130 دورة في الدقيقة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ باستخدام قوارير ديلونج Erlenmeyer إما زجاجية أو يمكن التخلص منها.
      ملاحظه: يوصى بشدة باستخدام قارورة محيرة بغطاء تهوية لزيادة التحريك وتحسين نقل الغاز أثناء ظروف الاهتزاز. تم الحصول على انخفاض كبير في إنتاجية الأجسام المضادة باستخدام قوارير عادية (غير محيرة) بسبب التحريض المحدود لثقافة التعليق.
   2. حافظ على عدد الخلية بين 1-5 × 10⁶ خلايا / مل مع بقاء الخلية بنسبة >95٪. إذا زاد عدد الخلية بأكثر من 5 × 10⁶ خلايا / مل ، فقم بتقسيم الخلايا. لا تسمح أبدا لخلايا CHO بالوصول إلى أقل من 0.2 × 10⁶ خلايا / مل.
2. تعداء خلايا CHO
   1. تنمو خلايا CHO في 200 مل من الوسائط (2 × 10⁶ خلايا / مل) في قوارير محيرة ديلونج Erlenmeyer.
      ملاحظه: لطالما أنتجت الثقافات المعلقة المزروعة في قوارير محيرة إنتاجية أعلى من البروتين مقارنة بزراعتها في قوارير غير محيرة.
   2. في أنبوب سعة 15 مل ، خذ 5 مل من وسائط CHO FreeStyle وأضف 50 ميكروغرام من الحمض النووي لاستنساخ VH و 75 ميكروغرام من الحمض النووي لاستنساخ VL. دوامة لخلط جيدا.
   3. احتضان خليط الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق < / > ملاحظه: الحضانة الأطول تقلل من غلة البروتين.
   4. أضف 750 ميكرولتر من مخزون 1 مجم / مل من البولي إيثيلين إيثيلين (PEI) إلى محلول الحمض النووي وقم بدوامة الخليط بقوة لمدة 30 ثانية. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق إضافية < br / > ملاحظه: يجب أن يكون PEI طازجا. تقلل دورات التجميد والذوبان المتعددة من PEI من العائد الإجمالي بشكل كبير.
   5. أضف الخليط الكامل من الحمض النووي وجزيرة الأمير والأمير إدوارد إلى الخلايا أثناء هز القارورة يدويا. احتضان قوارير Erlenmeyer المحيرة على الفور مع الخلايا عند 37 درجة مئوية تهتز عند 130 دورة في الدقيقة.
3. التعبير
   ملاحظه: يحتوي الجسم المضاد على ببتيد إشارة إفرازي مصمم على نهايته الطرفية N ، مما يساعد على إفراز الأجسام المضادة في الوسائط.
   1. قم بزراعة الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة في اليوم الأول.
   2. في اليوم 2 ، أضف 2 مل من 100x عامل مضاد للتكتل و 2 مل من محلول مضاد للبكتيريا والفطريات 100x. قم بتحويل القارورة إلى درجة حرارة منخفضة (32-34 درجة مئوية) ، مع الاهتزاز عند 130 دورة في الدقيقة.
   3. في كل يوم خامس ، أضف 10 مل من تغذية Tryptone N1 ، و 2 مل من مكمل الجلوتامين 100x.
   4. استمر في عد الخلايا كل ثلاثة أيام باستخدام مقياس كثافة الدم بعد تلطيخ جزء من الخلايا ببقعة زرقاء مثقب. تأكد من بقاء صلاحية الخلية أعلى من 80٪.
   5. في اليوم 10 أو 11 ، احصد الوسط لتنقية الأجسام المضادة. قم بتدوير المزرعة عند 3000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 40-60 دقيقة ثم قم بتصفية الوسائط الشفافة باستخدام مرشحات زجاجة 0.22 ميكرومتر.
4. تنقية
   ملاحظه: يتم إجراء تنقية الأجسام المضادة باستخدام عمود بروتين-أ المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) ، باستخدام مضخة تمعجية.
   1. قم بموازنة العمود بحجم عمودين من المخزن المؤقت للربط (20 ملي مولار فوسفات الصوديوم عند الرقم الهيدروجيني 7.4).
   2. قم بتمرير الوسائط المفلترة التي تحتوي على جسم مضاد (تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.5) عبر العمود بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
   3. اغسل العمود بحجم المخزن المؤقت المكون من عمودين للربط.
   4. قم بتقطيع الجسم المضاد إلى 500 ميكرولتر باستخدام مخزن مؤقت للشطف 5 مل (30 ملي مولار من أسيتات الصوديوم عند درجة الحموضة 3.4).
   5. قم بتحييد الرقم الهيدروجيني للجسم المضاد الملطوع بإضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحييد (3 M من أسيتات الصوديوم عند الرقم الهيدروجيني 9) لكل جزء.
      ملاحظه: يحتوي الكسر رقم 3-6 على معظم الجسم المضاد. ينصح بالاحتفاظ بجميع الكسور في حالة تقويض الجسم المضاد في جزء لاحق مما كان متوقعا.
   6. قم بقياس تركيز الأجسام المضادة المنقاة باستخدام مقياس الطيف الضوئي عن طريق تحديد البروتوكول الافتراضي للغلوبولين المناعي G (IgG). يتم الحصول على التركيز النهائي للجسم المضاد بالملغم / مل من خلال النظر في الوزن الجزيئي ومعامل الامتصاص.

< p class = "jove_title" >2. وضع العلامات على الفلورسنت

ملاحظة: يتم تصنيف الأجسام المضادة بصبغة الأشعة تحت الحمراء التي تحتوي على مجموعة تفاعلية من إستر NHS ، والتي تتزاوج مع البروتينات وتشكل متراقا مستقرا. هذا التفاعل حساس للأس الهيدروجيني ويعمل بشكل أفضل عند درجة الحموضة 8.5. تظهر المترافقات الفلورية المسماة بالصبغة امتصاصا قصوى يبلغ 774 نانومتر ، والحد الأقصى للانبعاث يبلغ 789 نانومتر. الرقم الهيدروجيني 8.5 هو مفتاح الاقتران الفعال.

1. غسيل الكلى 0.5 مل من الجسم المضاد باستخدام كاسيت غسيل الكلى (0.1-0.5 مل) في 1 لتر من المخزن المؤقت للاقتران (50 ملي مولار عازلة فوسفات عند درجة الحموضة 8.5). بعد 4 ساعات ، انقل كاسيت غسيل الكلى إلى مخزن مؤقت جديد وقم بغسيل الكلى طوال الليل.
2. قم بإعداد تفاعل اقتران عن طريق إضافة 0.03 مجم من IRDye 800CW لكل 1 مجم من الجسم المضاد في حجم تفاعل 500 ميكرولتر.
   ملاحظه: يتم إذابة IRDye 800CW في DMSO بتركيز 10 مجم / مل.
3. قم بإجراء تفاعلات وضع العلامات لمدة 2 ساعة عند 20 درجة مئوية
   ملاحظه: زيادة الوقت لأكثر من ساعتين لا يحسن وضع العلامات.
4. تنقية المترافقات المصنفة عن طريق غسيل الكلى المكثف ضد 1x PBS.
5. قم بتقدير درجة وضع العلامات عن طريق قياس امتصاص الصبغة عند 780 نانومتر وامتصاص البروتين عند 280 نانومتر. مساهمة الصبغة في إشارة 280 نانومتر هي 3٪.
6. احسب نسبة الصبغة / البروتين باستخدام هذه الصيغة:
   
   حيث 0.03 هو عامل تصحيح لامتصاص الصبغة المستخدمة عند 280 نانومتر (أي ما يعادل 3.0٪ من امتصاصها عند 780 نانومتر) ، εDye و εProtein هي معاملات الانقراض المولي للصبغة والبروتين (الجسم المضاد) على التوالي.
   ملاحظة: εالصبغة هي 270،000 م ^-1 سم ^-1 و ε البروتين هو 203،000 م ^-1 سم ^-1 (ل IgG نموذجي) في خليط 1: 1 من PBS: الميثانول. قد يكون للبروتينات الأخرى غير IgG معاملات انقراض مولية مختلفة جدا. يعد استخدام معامل الانقراض الصحيح للبروتين محل الاهتمام أمرا ضروريا للتحديد الدقيق لنسبة D / P.
7. احسب تركيز البروتين النهائي باستخدام هذه الصيغة:
   
   ملاحظه: تأكد دائما من فعالية ربط المستضد للأجسام المضادة المصنفة وغير المصنفة باستخدام ELISA (مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم) أو قياس التدفق الخلوي قبل الشروع في الدراسات في الجسم الحي.

< p class = "jove_title" >3. دراسات الطعم الطبيعي للفأر

1. تحضير الخلايا السرطانية للحقن
   1. تنمو خلايا OVCAR-3 في RPMI-1640 Medium ، مع 10٪ من FBS و 1x البنسلين والستربتومايسين.
   2. في اليوم السابق للحقن ، قم بزراعة الخلايا في أطباق مزرعة جديدة مقاس 100 مم مع 10 مل من الوسط / الطبق الكامل. استخدم رقم الخلية 0.5-1 × 10⁶ خلايا / طبق.
   3. احتضان المزارع عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ، ورطوبة 95٪ ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 20-24 ساعة.
   4. في يوم الحقن ، قم بإزالة وسط النمو من أطباق الاستزراع. اشطف طبقة الخلية جيدا باستخدام محلول ملحي خال من الفوسفات (DPBS) خال من Ca^{2 +} / Mg²+ لإزالة الخلايا الميتة والحطام الخلوي وجميع آثار المصل ، والتي قد تتداخل مع عمل التربسين.
   5. قم بتربسين الخلايا عن طريق إضافة 1.0-1.5 مل من محلول Trypsin-EDTA إلى كل طبق وحاول نشر المحلول عن طريق إمالة الطبق في كل مكان متبوعا بالحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق
      ملاحظه: راقب الخلايا تحت المجهر المقلوب للتحقق من حالة التربسين الفعلية. ينتج عن التربسين المفرط انفصال عدد أقل من الخلايا عن سطح طبق الاستزراع ، والإفراط في التربسين يؤدي إلى الإجهاد الخلوي. لذا ، فإن التربسين الصحيح مهم.
   6. أضف 1.0-1.5 مل من وسط النمو الكامل إلى كل طبق لإيقاف عمل التربسين ، وبعد ذلك أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة برفق.
      ملاحظه: سحب العينة اللطيف مهم للحفاظ على صحة الخلايا.
   7. اجمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بالدوران عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   8. اجمع حبيبات الخلية بعد إزالة المادة الطافية واغسل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الحبيبات في 1x DPBS.
   9. قم بتدوير تعليق الخلية بسرعة منخفضة تبلغ 250 × جم لمدة 5 دقائق.
   10. أضف 500 ميكرولتر من DPBS وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف للحصول على تعليق أحادي الخلية.
   11. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي.
       ملاحظه: للحصول على دقة أفضل ، كرر العد ثلاث مرات وخذ المتوسط.
   12. اضبط مستوى الصوت بحيث تكون كثافة الخلية النهائية 1 × 10⁸ خلايا / مل.
2. الحقن تحت الجلد للخلايا لتطوير الطعوم الغريبة للفأر
   ملاحظه: يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة أمان BSL2. تم استخدام الفئران Nude Foxn1^nu / Foxn¹⁺ في الدراسة الحالية.
   1. خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب سعة 1.5 مل واخلطه مع 50 ميكرولتر من وسط مصفوفة الغشاء القاعدي.
      ملاحظه: يميل وسط مصفوفة الغشاء القاعدي إلى تكوين حالة تشبه الهلام في درجة حرارة الغرفة ، لذا حافظ بعناية على الخلايا وخليط المصفوفة المتوسط على الجليد. ينصح بالاحتفاظ بالأنابيب والنصائح والمحاقن في الثلاجة ثم نقلها على الثلج قبل حقن.
   2. حرك الخليط لتجنب أي تكتل للخلايا. بعد ذلك ، خذ هذا 100 ميكرولتر من خليط متوسط المصفوفة المعلقة للخلية الذي يحتوي على 5 × 10⁶ خلايا ، في حقنة 1 سم مكعب.
   3. ارفع جلد برفق لفصل الجلد عن الطبقة العضلية الأساسية وحقن معلق الخلية ببطء (100 ميكرولتر) تحت الجلد (5 × 10⁶ خلايا) ، بإبرة 26 جرام. انتظر بضع ثوان قبل إخراج الإبرة ، بحيث يمكن لوسط المصفوفة السفلية أن يشكل بنية شبه صلبة تشبه الهلام جنبا إلى جنب مع الخلايا الموجودة تحت الجلد ، مما يمنع خروج الخليط من موقع الحقن.
      ملاحظه: تحتاج الخلايا إلى الاختبار قبل الحقن بحثا عن أي تلوث قد يضر بالفئران التي تعاني من نقص المناعة. أثناء الحقن ، لا تضع الإبرة بعمق شديد في الجلد لأن هذا قد يشكل الورم أعمق من المتوقع.
   4. احتفظ بالحيوان في قفص معقم وراقب لمدة 20 دقيقة تقريبا.
   5. راقب الفئران لمدة 2-3 أسابيع واترك الورم ينمو حتى 500 مم³ في الحجم.

4. توطين الأجسام المضادة باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي

ملاحظة: تستخدم معدات التصوير في الجسم الحي (انظر جدول المواد) المستخدمة في هذه التجربة مجموعة من المرشحات عالية الكفاءة وخوارزميات فك الخلط الطيفي للتصور غير الجراحي وتتبع النشاط الخلوي والجيني داخل الكائن الحي في الوقت الفعلي. يوفر النظام كلا من القدرة على مراقبة التألق والتلألؤ الحيوي.

1. حقن 25 ميكروغرام من الجسم المضاد المسمى بالصبغة عبر الوريد الذيلي.
   1. تخدير الفئران الحاملة للورم باستخدام 2٪ إيزوفلوران. تحقق من عدم الاستجابة لردود الفعل الدواسة.
   2. بمجرد أن تتوقف الفئران عن الحركة ، قم بتوسيع الوريد الجانبي عن طريق وضع ماء الدودة.
   3. حقن 25 ميكروغرام (في 100 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الملصقة باستخدام حقنة أنسولين 1 سم مكعب بإبرة 26 جرام.
   4. وبالمثل ، كعنصر تحكم سلبي ، قم بتسمية وحقن الجسم المضاد غير المحدد IgG1 Isotype الذي لا يستهدف الخلايا السرطانية.
2. إجراء التصوير المباشر في الجسم الحي بعد 8 ، 24 ، 48 ساعة ، وما إلى ذلك من حقن الأجسام المضادة.
   1. في البرنامج المقترن، انقر فوق تهيئة الموجودة في لوحة التحكم، وتأكد من أن درجة حرارة المرحلة هي 37 درجة مئوية.
   2. قم بتشغيل إمداد الأكسجين ، وجميع المضخات الموجودة في نظام التخدير ، وإمداد غاز الأيزوفلوران إلى غرفة التخدير ، واضبط صمام مبخر الأيزوفلوران على 2٪.
   3. انقل الفئران إلى غرفة التخدير وانتظر حتى يتم تخدير الفئران تماما. ضع مرهم ترطيب العين لتجنب جفاف عيونهم.
   4. انتقل إلى لوحة التحكم ، وقم بإعداد التصوير الفلوري من خلال خيار معالج التصوير ، وحدد الإثارة عند 773 نانومتر والانبعاث عند 792 نانومتر
      ملاحظه: توفر إعدادات التعريض التلقائي الافتراضية صورة فلورية جيدة. ومع ذلك ، يمكن تعديل تفضيلات التعريض الضوئي التلقائي حسب الاحتياجات.
   5. انقل الفئران المخدرة إلى غرفة التصوير وقم بتجميعها في مجال التصوير باستخدام مخروط الأنف. توفر مرحلة التصوير خيار استيعاب 5 فئران في المرة الواحدة.
      ملاحظه: اجعل الفئران التحكم مع فئران الاختبار لديها قدر مماثل من التعرض والإعدادات الأخرى أثناء التحليل.
   6. بمجرد أن يصبح كل شيء جاهزا ، حدد خيار الحصول على لوحة التحكم للحصول على الصورة.
   7. باستخدام إعدادات التعريض الضوئي التلقائي ، يقوم النظام بإنشاء الصورة في غضون دقيقة. الصورة التي تم إنشاؤها هي تراكب التألق على الصورة الفوتوغرافية مع شدة التألق البصري المعروضة بوحدات التهم أو الفوتونات أو من حيث الكفاءة.
   8. بعد الحصول على الصورة ، انقل الفئران من غرفة التصوير مرة أخرى إلى قفصها وراقب تعافيها لمدة 1 إلى 2 دقيقة.
3. قم بضبط الصورة بشكل أكبر باستخدام الأدوات والوظائف المتوفرة في البرنامج لتحليل الصور. أدوات تحليل الصور موجودة في شريط القائمة ولوحة الأدوات.
   1. ضمن ضبط الصورة، اضبط السطوع أو التباين أو التعتيم، وحدد مقياس الألوان.
   2. استخدم أدوات عائد الاستثمار لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) في صورة بصرية وقياس شدة الإشارة داخل عائد الاستثمار. إذا لزم الأمر ، قم بتصدير بيانات الإشارة الكمية إلى برنامج جداول البيانات ورسم البيانات.
   3. لدراسات المتابعة ، قم بتحليل تشريح الفئران لأنسجة مختلفة (على سبيل المثال ، الكبد والرئة والقلب والكلى والطحال والدماغ وما إلى ذلك) جنبا إلى جنب للحصول على توزيع مفصل غير محدد للأجسام المضادة المصنفة بالفلور><سنت. ملاحظه: يمكن دعم البيانات بشكل أكبر باستخدام ELISA الخاصة بالأنسجة من خلال استخدام المستضد (FOLR1 في هذه الحالة) في 96 فحصا للبئر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسائط فري ستايل CHO جيبكو لايف تكنولوجيز القط # 12651-014 مضاد مضاد (100X) جيبكو لايف تكنولوجيز قطة # 15240-062 عامل مضاد للتكتل جيبكو لايف تكنولوجيز القط # 01-0057DG حقنة الأنسولين BD BD العلوم البيولوجية قطة # 329420 طيف الفرجار IVIS بيركين إلمر القط # 124262 CHO CD EfficientFeed B جيبكو لايف تكنولوجيز القط #A10240-01 كورنينج 500 مل DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco) كورنينج قطة # 10-13-السيرة الذاتية كورنينج 500 مل RPMI 1640 كورنينج قطة # 10-040-السيرة الذاتية Cy5 المترافق المضاد للإنسان IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية قطة # 709-175-149 جلوتا ماكس الأول (100X) جيبكو لايف تكنولوجيز قطة # 35050-061 طقم HiPure Plasmid Maxiprep إنفيتروجين قطة # K21007 HiTrap Mabحدد عمود SuRe جنرال إلكتريك للرعاية الصحية القط # 11-0034-93 نقيع تاكارا للعلوم البيولوجية STO344 IRDye 800CW NHS Ester ليكور قطة # 929-70020 إيزوفلوران ، USP كوفيتروس قطة # 11695-6777-2 مرهم العين المزيوت تحديث Lacri-Lube قطة # 4089 ماتريجيل كورنينج القط # 354234 كاشف تعداء PEI ثيرمو فيشر القط # BMS1003A كاسيت غسيل الكلى Slide-A-Lyzer الترمو: العلمية قطة # 66333 مرشحات فراغ Steritop ميليبور إكسبريس #S2GPT02RE القط التربسين EDTA جيبكو لايف تكنولوجيز قطة # 15400-054 النماذج التجريبية: خطوط الخلايا الإنسان: OVCAR-3 مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC HTB-161 الإنسان: خلايا CHO-K إسطبل متحول في مختبرنا ATCC CCL-61 الماوس: 4T1 هدية طيبة من الدكتور تشيب لاندن ، UVA الماوس: MC38 هدية طيبة من الدكتورة سوزان أوستراند روزنبرغ ، UMBC تمت المصادقة عليها بواسطة التنميط STR الماوس: MC38 hFOLR1 تم إنشاؤه في مختبرنا (هذه الورقة) النماذج التجريبية: حيواني الفئران: رياضي عارية Foxn1^نو / Foxn1⁺ إنفيجو أوامر متعددة الفئران: NOD.Cg Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl / SzJ مختبر جاكسون أوامر متعددة