تلطيخ قياس التدفق الخلوي للمجموعات السكانية الفرعية المصابة بالبلاعم المصابة بالمتفطرة السلية

الملخص

المصدر: Mily، A.، et al. استقطاب الخلايا البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة M1 و M2 وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي على عدوى المتفطرة السلية. J. Vis. إكسب. (2020)

يعرض هذا الفيديو استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحة متعددة الألوان لتحليل بقاء الخلية وعلامات محددة مضادة للأجسام المضادة للإنسان مترافقة بالفلورسنت. يتيح هذا النهج تحديد النسبة المئوية لمجموعات الخلايا المصابة بالمتفطرة السلية بدقة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ قياس التدفق الخلوي للخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة المصابة ب Mtb

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في منشأة BSL-3. يمكن إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي في صفيحة 96 بئرا بدلا من الأنابيب.

1. افصل المتفطرة السلية والخلايا المصابة ب Mtb (والضوابط غير المصابة) عن الآبار الموجودة في 6 ألواح (صفائح) الآبار عن طريق الحضانة مع 1 مل من عازلة FACS لكل بئر لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات للتأكد من انفصال الخلايا. إذا أمكن ، تأكد من انفصال الخلية بالفحص المجهري. انقل تعليق الخلية من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مغطى بالمسمار وقم بتدوير الأنابيب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية بعناية عن طريق سحب العينات.
3. اغسل حبيبات الخلية في كل أنبوب مرتين باستخدام عازلة FACS وقم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
4. تلطيخ الخلايا (حوالي 0.5 × 10⁶ إلى 1 × 10⁶ خلايا / أنبوب) بحوالي 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة للإنسان المترافقة بالفلوروكروم بما في ذلك TLR2 (AF647) و CD206 (APC-Cy7) و CD163 (BV605) و CD80 (BV650) و CCR7 (BV711) و CD86 (BV786) و CD200R (PE) و CD64 (PE-Dazzle 594) و HLA-DR (PE-Cy5) (الجدول 1) بالاشتراك مع صبغة الجدوى Zombie-UV لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية (الثلاجة) في الظلام.
5. اغسل الخلايا الملطخة مرتين باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتدوير الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
6. قم بإصلاح الخلايا الملطخة ب 200 ميكرولتر من مخزن التثبيت (معد حديثا) لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام لضمان التعطيل الكامل للبكتيريا الفطرية.
7. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بالدوران عند 200 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة المخزن المؤقت الزائد للإصلاح.
8. أعد تعليق الخلايا الثابتة في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وانقل العينات إلى أنابيب جديدة للطرد المركزي الدقيق سعة 1 مل قبل إخراجها من مختبر BSL-3 لقياس التدفق الخلوي في BSL-2. قم بتخزين الخلايا الملطخة عند +4 درجة مئوية حتى الحصول على العينة.
   ملاحظه: رش الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل إخراجها من مختبر BSL-3. الفورمالديهايد سام (مسرطن) ويجب التعامل معه في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية. تخلص من نفايات الفورمالديهايد في نفايات كيميائية منفصلة.

< p class = "jove_title" >2. الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي وتحليلها للخلايا المشتقة من الخلايا الوحيدة المصابة ب Mtb

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 2.1-2.2 قبل تلطيخ قياس التدفق الخلوي الموصوف أعلاه. لتجنب مشاكل تكتل الخلايا وتفكك الأصباغ الترادفية بعد تثبيت الخلايا ، يتم إجراء الحصول على عينة من كل من الخلايا المصابة ب Mtb وغير المصابة في غضون 4-10 ساعات بعد تلطيخ الأجسام المضادة الأولية.

1. قبل تلطيخ قياس التدفق الخلوي الموصوف أعلاه ، قم بتعويض إشارة الفلورسنت لكل جسم مضاد مترافق بالفلوروكروم مدرج في لوحة التلوين (الجدول 1) باستخدام حبات التعويض (الإيجابية والسلبية).
2. قم بمعايرة تخفيف الجسم المضاد لتلوين البلاعم البشرية للحصول على الإشارة المثلى لكل فلوروكروم.
3. استخدم الخلايا غير الملوثة لتحديد مستوى مضان الخلفية اللازم لتعيين بوابة لمجموعة الخلايا السالبة التي تسمح بتصور الخلايا الملطخة (البلاعم شديدة الفلورسنت الذاتي).
4. احصل على ما لا يقل عن 50,000 خلية / عينة في مقياس التدفق الخلوي باستخدام البرنامج الموصى به للحصول على البيانات.
5. تصدير ملفات الاقتناء من مقياس التدفق الخلوي بتنسيق 3.1 لقياس التدفق الخلوي.
6. تحليل ملفات FCS في برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.
7. بوابة البلاعم وفقا لخصائصها المشتتة الأمامية والجانبية (FSC و SSC) واستبعاد الخلايا الميتة عن طريق بوابات الخلايا الحية / الميتة باستخدام صبغة الجدوى للأشعة فوق البنفسجية Zombie.
8. تصور البلاعم المصابة ب H37Rv-GFP في قناة FITC.
9. حدد تواتر الخلايا الملطخة إيجابيا ومتوسط كثافة التألق الهندسي (MFI) لجميع العلامات (الجدول 1).

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة المستخدمة في قياس التدفق الخلوي.

ليزر راووق فلوروكروم الظاهري دالة استنساخ رقم الكتالوج شركة 639 م 670/30 AF647 TLR2 مستقبلات التعرف على مسببات الأمراض TL2.1 309714 بيو ليجند 639 م 780/60 APC-Cy7 CD206 مستقبلات مانوز 15-2 هاتف: 321120 بيو ليجند 405 610/20 BV605 سي دي 163 مستقبلات الزبال جي إتش آي/61 333616 بيو ليجند 405 670/30 BV650 سي دي 80 جزيء التحفيز المشترك 2D10 305227 بيو ليجند 405 710/50 بف711 CCR7 مستقبلات الكيموكين G043H7 353228 بيو ليجند 405 780/60 BV785 سي دي 86 جزيء التحفيز المشترك it2.2 305442 بيو ليجند 488 530/30 البرنامج التأسيسي متري البكتيريا داخل الخلايا 561 ريال 586/15 PE CD200R مستقبلات مثبطة أوكس-108 329306 بيو ليجند 561 ريال 620/14 PE / انبهار 594 CD64 مستقبلات جاما Fc I من IgG 10.1 [م] 305032 بيو ليجند 561 ريال 661/20 PE-Cy5 (PC5) HLA-DR جزيء معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية L243 307608 بيو ليجند 355 ريال 450/50 BUV395 صبغة الجدوى علامة الخلية الحية / الميتة غيبوبة الأشعة فوق البنفسجية 423108 إنفيتروجين

المواد