اختبار في المختبر لدراسة القدرة السامة للخلايا للخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكينات

الملخص

المصدر: Hsiao ، C. H. ، et al. عزل وتوسيع الخلايا التائية القاتلة التي يسببها السيتوكينات السامة للخلايا لعلاج السرطان. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لقياس القدرة السامة للخلايا للخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكين (CIK) ضد الخلايا السرطانية. عند الزراعة المشتركة للخلايا السرطانية المستهدفة مع خلايا CIK ، يتم تحديد الخلايا السرطانية الميتة باستخدام صبغة الفلورسنت للبقاء ويتم قياسها كميا باستخدام قياس التدفق الخلوي ، وتقدير التأثير السام للخلايا لخلايا CIK.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

1. قم بتخزين الكواشف والأجسام المضادة والمواد الكيميائية كما هو موضح في ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS). قم بإذابة الأدوية أو السيتوكينات في المذيبات كمحاليل مخزون ثم قم بتخزينها عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية < / > ملاحظه: يتم ملاحظة المعلومات التفصيلية لإعداد المواد في جدول المواد.

فئة

2. عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)

1. قم بتسخين محلول تدرج الكثافة (جدول المواد) إلى 18-20 درجة مئوية قبل الاستخدام. اقلب زجاجة المحلول عدة مرات لضمان الخلط الشامل.
2. اجمع 3-5 مل من عينة الدم الوريدية البشرية في قارورة هيبارينية واخلطها جيدا عن طريق قلب الأنبوب برفق عدة مرات.
3. تحضير 4 مل من محلول تدرج الكثافة في أنبوب معقم سعة 15 مل.
4. ضع طبقة 1 مل من عينة الدم بعناية على محلول تدرج الكثافة.
5. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة عند 18-20 درجة مئوية (قم بإيقاف تشغيل الكسر).
قم
6. بشفط طبقة الطبقة المصفرة من الخلايا أحادية النواة (حوالي 1 مل) بعناية وعلى الفور دفعة واحدة لتجنب إزعاج الطبقات إلى أنبوب معقم سعة 15 مل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل.
7. أضف ما لا يقل عن 3 أحجام (~ 3 مل) من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى الطبقة المصقولة في أنبوب الطرد المركزي. قم بتعليق الخلايا عن طريق ماصتها برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة.
8. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 18-20 درجة مئوية.
9. قم بتعليق حبيبات الخلية ب 5 مل من الوسط القاعدي (جدول المواد) وانقلها إلى قارورة. زراعة الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

< p class = "jove_title" >3. تحريض CIK والتوسع

1. في اليوم 0 ، استزراع PBMCs (1 × 10⁶) في وسط قاعدي طازج يحتوي على 1,000 وحدة دولية / مل من IFN-γ لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. في اليوم الأول ، قم بتحديث الوسط بوسط قاعدي طازج يحتوي على 50 نانوغرام / مل من الجسم المضاد ل CD3 ، و 1 نانوغرام / مل من IL-1α المؤتلف البشري (rh) ، و 1,000 U / مل من rh IL-2. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام.
3. في اليوم 7 ، قم بتحديث الوسط بوسط قاعدي طازج يحتوي على 1,000 وحدة / مل من rh IL-2. قم بتحديث الوسط كل 3 أيام حتى نهاية تمدد الخلية (اليوم 14).

< p class = "jove_title" >4. التنميط المناعي لتقييم خلايا CIK

1. اغسل خلايا CIK ب 10 مل من PBS المعقم. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم و 18-20 درجة مئوية ، قم بشفط المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا ب 10 مل من PBS. احسب رقم الخلية واختبار صلاحية الخلية باستخدام مقايسة استبعاد trypan blue.
2. قم بتقسيم خلايا CIK إلى ستة أنابيب معقمة سعة 1.5 مل بكثافة ~ 5-10 × 10⁵ خلايا / مل PBS. تسمية وعلاج على النحو التالي: الأنبوب 1 ، فارغ (بدون جسم مضاد) ؛ الأنبوب 2 ، أضف 20 ميكرولتر من النمط المتماثل IgG1-FITC ؛ الأنبوب 3 ، أضف 20 ميكرولتر من النمط المتماثل IgG1-APC mAbs ؛ الأنبوب 4 ، أضف 20 ميكرولتر من CD3-FITC ؛ الأنبوب 5 ، أضف 20 ميكرولتر من CD56-APC mAbs ؛ والأنبوب 6 ، أضف 20 ميكرولتر من CD3-FITC و 20 ميكرولتر من CD56-APC mAbs.
3. امزج خلايا CIK برفق مع الأجسام المضادة عن طريق ماصتها برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل ، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
قم
4. بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 300 × جم و 18-20 درجة مئوية. قم بتثبيتها برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل.
5. كرر الخطوة 4.4.
6. اترك الأنابيب في الظلام قبل تحليل التدفق الخلوي.

5. التعرف على علامة القرص المضغوط

1. انقل معلق الخلية إلى أنبوب معقم من البوليسترين مستدير بسعة 5 مل مع غطاء مصفاة خلية (شبكة 100 ميكرومتر) عن طريق سحب العينة برفق عبر الغطاء. ضع الأنابيب على الرف الدائري بالترتيب.
2. افتح برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي وأنشئ مجلدا تجريبيا. انقر فوق الزر عينة جديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة وتسمية الأنابيب على النحو التالي: الأنبوب 1 ، فارغ ؛ أنبوب 2 ، النمط المتماثل IgG1-CD3 ؛ أنبوب 3 ، النمط المتماثل IgG1-CD56 ؛ أنبوب 4 ، CD3 ؛ أنبوب 5 ، CD56 ؛ الأنبوب 6 ، CD3CD56.
3. قم بإنشاء نظام بوابات مبعثرة لمجموعات خلايا CIK (الشكل 1 أ).
   1. حدد الأنبوب 1 (فارغ) وانقر فوق الزر Dot Plot لإنشاء مخطط FSC-A / SSC-A. ارسم بوابة مستطيلة فوق مجموعة الخلايا بأكملها بعتبة FSC-A >5 × 10⁴ لاستبعاد بقايا الخلية.
   2. حدد المعلمة SSC-A/SSC-H للمخطط النقطي الجديد وارسم بوابة مضلع حول جميع الخلايا المفردة. حدد المعلمة Count/FITC (CD3) وCount/APC (CD56) لمخطط الرسم البياني الجديد، على التوالي. حدد المعلمة FITC (CD3) / APC (CD56) للمخطط النقطي الجديد وارسم بوابة رباعية بأربعة لتحديد المجموعات الفرعية الأربعة.
   3. سجل البيانات من 20,000 خلية مفردة في كل عينة. انقر فوق تحميل العينة زر لتحليل نموذج عنصر التحكم فارغ أولا. حدد مجموعة خلايا CIK بأكملها باستخدام معلمات قناة CD56 و CD3.
4. كرر الخطوة 5.3 للتحقيق في جميع العينات.
5. افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية للعينة الفردية لتحليل مجموعات خلايا CIK وإعادة طباعتها في ملفات التحليل.

فئة < p = "jove_title" >6. زراعة وتلوين خلايا سرطان الدم النخاعي المزمن K562 البشرية وخلايا سرطان المبيض OC-3

1. خلايا K562
   1. زراعة خلايا K562 في وسط كامل (الوسط القاعدي RPMI يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 50 وحدة / مل من المضادات الحيوية وضبط الجلوكوز إلى 4.5 جم / لتر) بكثافة 0.5-1 × 106 خلية / مل في قارورة زراعة الخلايا وتحتضن في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   2. انقل وسائط الاستزراع التي تحتوي على خلايا K562 إلى أنابيب معقمة سعة 50 مل وحبيبات الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 18-20 درجة مئوية في يوم التجربة.
   3. شفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من PBS المعقم ، واخلطها جيدا برفق.
   4. قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في PBS ، واضبط خلايا K562 على تركيز 0.5-1 × 10⁶ خلايا / مل.
   5. أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة كربوكسي فلوريسين سوكسينيمديل إستر (CFSE) إلى 1 مل من معلق خلية K562 في أنبوب معقم سعة 15 مل بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر.
   6. اترك الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 10-15 دقيقة.
   7. أضف 9 مل من PBS إلى الأنبوب وحبيبات الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية ثم حبيبات الخلية في 10 مل من الوسائط الكاملة. انقل معلق الخلية إلى قارورة زراعة الخلايا وضعها في الحاضنة.
2. خلايا OC-3
   1. زراعة خلايا OC-3 في وسط كامل (وسط DMEM / F12 يحتوي على 10٪ FBS و 50 U / مل من المضادات الحيوية) بكثافة 0.5-1 × 10⁶ خلايا في قارورة زراعة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. استنشق وسائط الثقافة واغسل الخلايا باستخدام PBS قبل يوم واحد من التجربة.
   3. افصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول إنزيم تفكك الخلايا (جدول المواد) واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   4. الخلايا بإضافة 5 مل من PBS واخلطها جيدا برفق. حبيبات الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق وشفط المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في PBS واضبط الخلايا على تركيز 0.5-1 × 10⁶ خلايا / مل.
   5. أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة CFSE إلى 1 مل من معلق خلية OC-3 في أنبوب معقم سعة 15 مل بتركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر.
   6. اترك الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 10-15 دقيقة.
   7. أضف 9 مل من PBS إلى الأنبوب وحبيبات الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية ثم قم بتعليق حبيبات الخلية بوسائط كاملة. قم بالبذور 5 × 10⁵ خلايا / بئر في صفيحة 6 آبار واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ طوال الليل.

< p class = "jove_title" >7. الفحص السام للخلايا

1. الزراعة المشتركة لخلايا CIK و K562 (CIK-K562)
   1. احسب خلايا K562 من الخطوة 6.1.7 واختبر صلاحية الخلية عن طريق مقايسة استبعاد الtrypan blue. أضف 1 مل من خلايا K562 إلى كل بئر في صفيحة 6 آبار بكثافة 5 × 10⁵ / مل.
   2. أضف 1 مل من الوسط القاعدي مع أو بدون خلايا CIK من الخطوة 3.4 إلى لوحة 6 بئر من الخطوة 7.1.1 على النحو التالي: حسنا 1 = خلايا فارغة ، K562 وحدها (5 × 10⁵) ؛ حسنا 2 = خلايا K562 ملطخة ب CFSE وحدها (5 × 10⁵) ؛ حسنا 3 = خلايا CIK (E [مستجيب] ، 25 × 10⁵) + خلايا K562 ملطخة ب CFSE (T [الهدف] ، 5 × 10⁵) ؛ حسنا 4 = خلايا CIK (E ، 50 × 10⁵) + خلايا K562 ملطخة ب CFSE (T ، 5 × 10⁵).
   3. امزج معلقات الخلية عن طريق ماصتها برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
2. الزراعة المشتركة لخلايا CIK و OC-3 (CIK-OC-3)
   1. أضف 1 مل من الوسط القاعدي مع أو بدون خلايا CIK من الخطوة 3.4 إلى لوحة 6 بئر من الخطوة 6.2.7 على النحو التالي: حسنا 1 = خلايا فارغة ، OC-3 وحدها (5 × 105) ؛ حسنا 2 = خلايا OC-3 الملطخة ب CFSE وحدها (5 × 10⁵) ؛ حسنا 3 = خلايا CIK (E ، 25 × 10⁵) + خلايا OC-3 ملطخة ب CFSE (T ، 5 × 10⁵) ؛ حسنا 4 = خلايا CIK (E ، 50 × 10⁵) + خلايا OC-3 ملطخة ب CFSE (T ، 5 × 10⁵).
   2. امزج معلقات الخلية عن طريق ماصتها برفق لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
3. 7-صبغة أمينوأكتينومايسين د (7-AAD)
   1. احصد معلق الخلية CIK-K562 من الخطوة 7.1.3 مباشرة إلى أنبوب معقم سعة 15 مل.
   2. احصد كل من الخلايا المعلقة والملتصقة من مجموعات CIK-OC-3 من الخطوة 7.2.2.
      1. انقل معلق الخلية إلى أنبوب معقم سعة 15 مل. اغسل البئر ب 1 مل من PBS المعقم ، واجمع PBS ، وأضفه إلى الأنبوب. أضف 0.5 مل من محلول إنزيم تفكك الخلايا ، واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      2. أضف 1 مل من المحلول من نفس الأنبوب إلى البئر المقابل واخلط الخلايا برفق عن طريق سحب ماصتها لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل. اجمع كل الخلايا في نفس الأنبوب.
   3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق ، وقم بشفط المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من PBS المعقم. قم بتكبيل الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق ، وشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS المعقم.
   4. أضف 5 ميكرولتر من صبغة 7-AAD (50 نانوغرام / ميكرولتر من المخزون) إلى تعليق الخلية. امزج الخلايا برفق عن طريق ماصتها لأعلى ولأسفل 3 مرات على الأقل باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل. احتضن لمدة 10 دقائق واتركه في الظلام قبل التحليل.
4. مقايسة القدرة المحللة للخلايا
   1. امزج تعليق الخلية من الخطوة 7.3.4 وكرر الخطوتين 5.1 و 5.2 مرة واحدة.
   2. انقر فوق الزر "عينة جديدة" لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة وقم بتسمية الأنابيب على النحو التالي: خلايا الأنبوب 1 أو K562 (أو OC-3) فقط. أنبوب 2 ، خلايا K562 ملطخة ب CFSE (أو OC-3) فقط ؛ أنبوب 3 ، E: T = 5: 1 ؛ أنبوب 4 ، E: T = 10: 1.
   3. قم بإنشاء نظام بوابات مبعثرة لمقايسة التحلل الخلوي (الشكل 2 أ).
      1. حدد الأنبوب 1 وانقر فوق الزر Dot Plot لإنشاء مخطط FSC-A / SSC-A. ارسم بوابة مستطيلة فوق جميع الأحداث بعتبة FSC-A >5 × 10⁴ لاستبعاد بقايا الخلية.
      2. حدد المعلمة SSC-A/CFSE للمخطط النقطي الجديد. حدد المعلمة 7-AAD/CFSE للمخطط النقطي الجديد وارسم بوابة من أربعة أرباع لتحديد المجموعات السكانية الفرعية الأربعة.
      3. انقر فوق تحميل العينة زر لتحليل نموذج التحكم الفارغ أولا.
      4. اضبط جهد SSC-A و FSC-A. حدد مجموعة الخلايا الميتة باستخدام معلمات قناة CFSE و 7-AAD. سجل البيانات من >000 20 خلية CFSE + في كل عينة.
   4. كرر القسم 7.4.6 للتحقيق في جميع العينات.
   5. افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية لكل عينة فردية لتحليل مجموعات الخلايا غير القابلة للحياة وتصدير البيانات إلى ملفات التحليل.

النتائج

الشكل 1: نسبة الخلايا التائية CD3 ⁺ CD56 ⁺ من عينة PBMC التمثيلية. (أ) تم التعرف على الخلايا الليمفاوية من خلال الحجم المحدد والحبيبات. مجموعة خلية واحدة مختارة للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. (ب) أجري التحليل الإحصائي لفعالية توسع CIK من ثلاثة متبرعين أصحاء باستخدام اختبار t (*، ص < 0.01).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 7-أمينو أكتينومايسين د دينار بحريني 559925 APC Mouse المضاد للإنسان CD56 الأجسام المضادة دينار بحريني 555518 ب 159 APC ماوس IgG1 ، κ التحكم في النمط المتماثل دينار بحريني 555751 MOPC-21 BD FACSمقياس التدفق الخلوي الثاني دينار بحريني 338962 SN: R33896202856 كاربوكسي فلوريسين ثنائي الأسيتات إستر السكسينيديل (CFSE) دينار بحريني 565082 إعادة تركيب صبغة CFSE (500 مجم) مع 90 مل من DMSO D- (+) - محلول الجلوكوز سيغما جي 8644 لزراعة الخلايا K562. أضف 12.5 مل إلى 500 مل من الوسط الكامل Dulbecco's Modified Eagle Medium / F12 HyClone SH30023.02 الوسط القاعدي لزراعة خلايا OC-3 مصل الأبقار الجنينية HyClone SH30084.03 لزراعة الخلايا K562 و OC-3. الوسيط الكامل يحتوي على 10٪ من FBS فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية لعلوم الحياة 71101700-EK حل تدرج الكثافة FITC Mouse الأجسام المضادة CD3 المضادة للإنسان دينار بحريني 555332 UCHT1 ماوس FITC IgG1 ، κ التحكم في النمط المتماثل دينار بحريني 555748 MOPC-21 الإنسان المضاد ل CD3 mAb تاكارا تي 210 OKT3 أضف 2.5 مل من المرق (1 مجم / 1 مل) إلى 50 مل من وسط الحث. مخزون التخزين عند -80 درجة مئوية البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15140122 أضف 5 مل من المخزون (10,000 وحدة / مل) إلى 500 مل من الوسط الكامل. مخزون التخزين عند 4 درجات مئوية. برولوكين نوفارتيس إعادة تكوين مسحوق Proleukin (22 × 106 وحدة دولية) مع 1.2 مل من الماء المعقم وإضافة 2.7 مل إلى 50 مل من وسط الحث. مخزون التخزين عند -20 درجة مئوية المؤتلف البشري إنترفيرون جاما سيلجينيكس 1425-050 إعادة تكوين rh IFN-g (5x105 وحدة دولية / 50 ميكروغرام) مع 200 ميكرولتر من الماء المعقم وإضافة 20 مل إلى 50 مل من وسط الحث. مخزون التخزين عند -20 درجة مئوية المؤتلف البشري إنترلوكين -1 ألفا PEPROTECH 200-01 أ إعادة تكوين rh IL-1α (10 ميكروغرام) مع 1 مل من الماء المعقم وإضافة 5 مل إلى 50 مل من وسط الحث. مخزون التخزين عند -20 درجة مئوية RPMI1640 متوسط جيبكو 11875-085 الوسط القاعدي لزراعة الخلايا K562. مخزون التخزين عند 4 درجات مئوية جهاز طرد مركزي سيجما 3-18 كيلو سيغما 10295 إنزيم TrypLE Express جيبكو 12605028 إنزيم تفكك الخلية; لفك ارتباط الخلايا الملتصقة. التخزين في درجة حرارة الغرفة X-VIVO 15 متوسط لونزا 04-418س الوسط القاعدي لخلايا PBMC و CIK. التخزين عند 4 درجات مئوية