تحريض التهاب الأمعاء والقولون الناخر في نموذج الأمعاء الظهارية البشري

Abstract

المصدر: Ares, G. J., et al. نموذج معوي بشري جديد لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر. J. Vis. Exp.(2019).

يوضح هذا الفيديو تطور مرض التهاب الأمعاء والقولون الناخر في نموذج معوي لحديثي الولادة مشتق من الإنسان ناجم عن علاج عديدات السكاريد الدهنية. يساعد هذا النموذج في دراسة الفيزيولوجيا المرضية المعوية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

1. تحضير الكاشف

1. تحضير محلول مخزون Culture Media لجمع الأنسجة الكاملة: 1 لتر من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، و 110 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 11 مل من البنسلين والستربتومايسين (التركيز النهائي 1٪) ، و 1.1 مل من الأنسولين المعقم بالترشيح (التركيز النهائي 0.1٪). تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية.
2. تحضير المخزن المؤقت المخلب # 1: 30 مل من وسائط الثقافة (كما هو موضح في 1.1) ، 600 ميكرولتر من 0.5 م حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (التركيز النهائي 10 ملليمتر) ، 300 ميكرولتر من الجنتاميسين (التركيز النهائي 1٪) و 60 ميكرولتر من الأمفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2٪). تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية.
3. تحضير المخزن المؤقت المخلب # 2: 30 مل من وسائط الاستزراع (كما هو موضح في 1.1) ، 300 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (التركيز النهائي 5 ملم) ، 300 ميكرولتر من الجنتاميسين (التركيز النهائي 1٪) و 60 ميكرولتر من الأمفوتريسين ب (التركيز النهائي 0.2٪). تخزين محلول المخزون في 4 درجات مئوية.
4. تحضير وسائط الأمعاء البشرية: 41.4 مل من DMEM / F-12 ، 5 مل من FBS (10 نهائية) ، 500 ميكرولتر من البنسلين الستربتومايسين (التركيز النهائي 1٪) ، 500 ميكرولتر من L-glutamine (التركيز النهائي 1٪) ، 500 ميكرولتر من الجنتاميسين (التركيز النهائي 1٪) ، 100 ميكرولتر من الأمفوتريسين B (التركيز النهائي 0.2٪) ، 500 ميكرولتر من 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) (التركيز النهائي 10 ملليمتر) ، 500 ميكرولتر من مكمل N-2 100x ، و 1 مل من مكمل B-27 50x مطروحا منه فيتامين A لحجم إجمالي قدره 50 مل. تخزين محلول المخزون عند -20 درجة مئوية.
5. تحضير وسائط الأمعاء البشرية الصغيرة: 10 مل من وسائط الأمعاء البشرية المصغرة (محضرة في 1.4) ، 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Wnt3a (التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل) ، 10 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Noggin (التركيز النهائي 100 نانوغرام / مل) ، 10 ميكرولتر من 1 مجم / مل R-Spondin (التركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل) ، 10 ميكرولتر من 500 ميكروغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) (التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل) ، 10 ميكرولتر من 1 م N-أسيتيل سيستين (التركيز النهائي 1 ملليمتر) ، 10 ميكرولتر من 10 ملي مولار Y-27632 (التركيز النهائي 10 ميكرومتر) ، 10 ميكرولتر من 500 ميكرومتر A-83 (التركيز النهائي 500 نانومتر) ، 10 ميكرولتر من 10 ملي مولار SB202190 (التركيز النهائي 10 ميكرومتر) ، 100 ميكرولتر من 1 م نيكوتيناميد (التركيز النهائي 10 ملليمتر) و 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر [ليو] 15-جاسترين 1 (التركيز النهائي 10 نانومتر). الحجم الكلي 10 مل. تخزين محلول المخزون عند 4 درجات مئوية
   ملاحظه: يجب استخدام الحلول في غضون 48 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. عزل القبو والطلاء من الأنسجة الكاملة

1. في وقت الجمع في جناح العمليات ، ضع عينة أنسجة الأمعاء الدقيقة البشرية في محلول ملحي ذو فوسفات مخزن من Dulbecco البارد (DPBS). اغسل العينة في DPBS بارد حتى تصبح خالية من البراز والدم. قم بتخزين العينة عند 4 درجات مئوية في RPMI 1640 متوسطة حتى تصبح جاهزة لعزل القبو
   ملاحظه: لا يمكن تخزين الأنسجة لأكثر من 24 ساعة.
   1. تأكد من خلو العينة من البراز والدم. باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بإزالة أي دهون زائدة أو مشابك / دبابيس جراحية ، إلخ. وزن العينة.
      ملاحظة: استهدف قطعة حوالي 0.75-2.5 جم.
2. قطعي العينة إلى قطع 0.5 سم وضعيها في 30 مل من Chelating Buffer # 1 (كما هو محضر في الخطوة 1.2).
   1. رج العبوة على سرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بتصفية الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وتخلص من التدفق من خلالها.
3. أضف الأنسجة إلى 30 مل من Chelating Buffer # 2 (كما هو محضر في الخطوة 1.3).
   1. رج العبوة على سرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بتصفية الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر وتخلص من التدفق من خلالها.
4. قم بإذابة 500 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد لاستخدامها في الخطوة 2.8.
5. أضف منديلا إلى 10 مل من DMEM البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ورجه بقوة باليد لمدة 10 ثوان.
   1. قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر واجمع التدفق من خلال (التسمية # 1). احتفظ بالأنبوب # 1 على الجليد.
   2. أضف منديلا إلى 10 مل أخرى من DMEM البارد في أنبوب مخروطي منفصل سعة 50 مل ورجه بقوة باليد لمدة 10 ثوان.
   3. قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر واجمع التدفق من خلال (التسمية # 2).
   4. كرر مرتين إضافيتين حتى يكون هناك أربعة أنابيب مخروطية الشكل مع تدفق من خلالها (تسمى الأنابيب # 1-4).
أنبوب
6. الترشيح # 1 الحل من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر ونقل التدفق من خلال أنبوب مخروطي 15 مل (التسمية # 1). كرر ل # 2-4.
   1. أنابيب الطرد المركزي 15 مل # 1-4 عند 200 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
7. في غطاء التدفق الصفحي ، قم بإزالة المادة الطافية من الأنابيب # 1-4 وتخلص منها. تجنب تعطيل سحابة الأنسجة فوق الحبيبات مباشرة ، حتى لو كان ذلك يعني ترك بعض المواد الطافية وراءها.
   1. عن طريق سحب العينة ببطء ، امزج الحبيبات مع بقايا المادة الطافية في أنابيب # 1-4.
   2. انقل الخليط من الأنابيب # 1-4 إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 2 مل.
   3. جهاز الطرد المركزي للأنبوب المخروطي عند 200 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
8. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي.
   ملاحظه: احتفظ بمصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد في جميع الأوقات واعمل بسرعة للخطوات التالية. هذا المنتج يتبلمر بسرعة كبيرة في درجة حرارة الغرفة.
   1. ضع 50 ميكرولتر من تعليق مصفوفة الغشاء القاعدي / العينة على مركز البئر في صفيحة 24 بئرا. يجب أن يظهر هذا على شكل قبة.
      ملاحظه: يساعد استخدام أطراف الماصة المبردة في نقل التعليق بشكل أكثر سلاسة، مما يقلل من البلمرة.
   2. كرر 9 مرات لملء 10 آبار إجمالية.
9. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا في 37 درجة مئوية ، حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة للسماح بالبلمرة.
10. أضف 500 ميكرولتر من وسائط الأمعاء البشرية المصغرة الكاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.5) إلى كل بئر. استبدل كل يومين.
11. اجمع الأمعاء بعد 5-10 أيام ، عندما يتم تصور التبرعم. راجع الخطوتين 4 و 5 للحصول على إرشادات التجميع.

< p class = "jove_title" >3. تحريض NEC التجريبي

1. أضف 10 ميكرولتر من 5 ملغم/مل من عديدات السكاريد الدهنية (LPS) إلى 500 ميكرولتر من وسائط الأمعاء البشرية الكاملة (كما هو محضر في الخطوة 1.5) في كل بئر في اليوم 0. استبدل كل 2 أيام حتى التجميع.

Materials