فحص الالتصاق في المختبر للكشف عن التصاق الخلايا السرطانية بمصائد العدلات خارج الخلية

الملخص

Najmeh, S., et al. عزل ومعالجة مصائد العدلات البشرية المبسطة خارج الخلية (NETs). J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح فحصا يستخدم الفحص المجهري الفلوري للكشف عن التصاق الخلايا السرطانية بمصائد العدلات خارج الخلية (NETs). في آبار الاختبار ، هناك زيادة ملحوظة في عدد الخلايا السرطانية المصنفة بالفلورسنت والتي تلتصق ب NETs ، في حين أن الآبار المعالجة ب DNase تظهر انخفاضا في التصاق الخلايا السرطانية ب NETs.

البروتوكول

فئة

1. فحص الالتصاق الثابت للخلايا السرطانية NET

1. أضف 100 ميكرولتر من مخزون NET الذي تم الحصول عليه مسبقا لكل بئر في صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا واتركها تغطي الآبار O / N عند 4 درجات مئوية في الظلام.
2. بين 12 و 20 ساعة بعد ذلك ، تحقق من تكوين طبقة أحادية موحدة من الشبكات الخالية من الخلايا في قاع الآبار تحت المجهر (الشكل 1). في هذه المرحلة ، قم بشفط جميع المواد غير الملتصقة برفق من الآبار ، مع التأكد من عدم تعطيل طبقة NET أحادية الطبقة في الأسفل.
3. أضف 100 ميكرولتر من محلول حجب ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 1٪ لكل بئر واتركه لمدة ساعة واحدة في RT.
4. افصل الخلايا السرطانية A549 عن قارورة T-75 باستخدام 2 مل من محلول التربسين 0.25٪. بمجرد فصلها ، أضف 10 مل من وسائط A549 إلى الخلايا المكربية وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق الخلايا في الوسائط للحصول على تركيز 2 × 10⁴ خلايا سرطانية لكل 100 ميكرولتر من الوسائط.
   ملاحظه: نمت خلايا A549 بشكل منفصل. باختصار ، تم زراعة الخلايا والحفاظ عليها في وسائط DMEM F12 التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين وتحضنها عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. بمجرد الوصول إلى 70-80٪ من التقاء الخلايا ، تم فصلها باستخدام 0.25٪ Trypsin-EDTA وإعادة تعليقها في نفس الوسائط الموضحة أعلاه.
5. تلطيخ الخلايا السرطانية باستخدام CFSE عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من CFSE لكل مل من الوسائط وتركها تلطخ في RT لمدة 10 دقائق. بعد التلوين ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 450 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في الحجم الأولي للوسائط للحصول على تركيز 2 × 10⁴ خلايا سرطانية لكل 100 ميكرولتر من الوسائط.
6. بعد ساعة واحدة من حجب NETs ، قم بشفط محلول الحجب برفق وأضف 2 × 10⁴ خلايا سرطانية في الوسائط ، أي ما يعادل 100 ميكرولتر ، لكل طبقة أحادية NET واتركها تلتصق لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بشفط الخلايا برفق وأضف 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر لغسل أي خلايا غير ملتصقة.
7. في بعض الآبار ، أضف 1000U من DNAse I لكل بئر لمدة 10 دقائق قبل الغسيل لتحلل NETs. سيكون هذا بمثابة تحكم سلبي. في الآبار الأخرى ، أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم لكل بئر لمدة 10 دقائق ، والتي ستكون بمثابة التحكم في السيارة (VC).
   ملاحظة: عادة ما يتم إجراء 3 نسخ مكررة لكل شرط لزيادة حجم العينة.
8. قم بالشفط والتخلص من جميع المحاليل في الآبار مع ترك NETs والخلايا السرطانية الملتصقة فقط في الأسفل. أضف 100 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ لكل بئر لإصلاح الخلايا السرطانية الملتصقة ب NETS وقراءة الفحص تحت المجهر الفلوري (الشكل 1). ارسم النتائج وحللها (الشكل 2).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. NET أحادي الطبقة. تظهر صور الفحص المجهري الخفيف لآبار الألواح المكونة من 96 بئرا والمغلفة بشبكات (أ) طبقة أحادية موحدة من الشبكات الشبكية في جميع أنحاء البئر بدلا من (ب) طلاء غير كاف للبئر بطبقة متقطعة من الشبكات الشبكية. تمثل أشرطة المقياس 40 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) من Dulbecco ، معدل ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم Wisent 311-425-CL RPMI-1640 متوسط مع L-glutamine Wisent 350-000-CL يتم تصنيع محلول 3٪ RPMI عن طريق استكمال RPMI بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 3٪ BD فارم ليز المخزن المؤقت للتحليل BD Biosciences 555899 الحمض النووي 1 روش 11284932001 F12 DMEM Wisent 319-075-CL مصل الأبقار الجنينية (FBS) Wisent 080-150 البنسلين / الستربتومايسين جيبكو 15140-122 CFSE إنفيتروجين ج 1157 0.25٪ تريبسين EDTA جيبكو هاتف: 25200-056