تلطيخ الخلايا البكتيرية والتحضير للدراسات المناعية

الملخص

المصدر: Yang، J. et al. ، الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن التصاق البكتيريا بالخلايا المضيفة.J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تلطيخ الخلايا البكتيرية وتحضيرها للدراسات المناعية باستخدام صبغة الفلورسنت الحمراء. يتم تخفيف البكتيريا الملطخة وتعليقها في وسط نمو لتحقيق التركيز البكتيري المطلوب لعدوى الخلية المضيفة ، مما يمثل تعدد العدوى.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title">1. نمو البكتيريا والتلوين

1. أداء جميع الأعمال البكتيرية في خزانة السلامة الحيوية ، مختبر السلامة الحيوية المستوى 2.
2. تلقيح جميع الثقافات البكتيرية ، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa (PAO1) ، والإشريكية القولونية ، والليستيريا monocytogenes ، و Bacillus subtilis ، وما إلى ذلك ، من مخزون الجلسرين المجمد وزراعتها في مرق الصويا Tryptic (TSB ، 3 مل) في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية طوال الليل يتم الحفاظ عليها عند 250 دورة في الدقيقة.
3. في اليوم التالي، استخدم التخفيف بنسبة 1:100 من المستزرعة الليلية لتلقيح استزراع فرعي وزراعتها في TSB (1 مل) لمدة 3 ساعات إلى المرحلة الأسية، وقم بقياس الكثافة البصرية، OD عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) للتأكيد. تأكد من أن OD₆₀₀ في حدود 0.4-0.6.
4. قبل إجراء اختبار الالتصاق بمضيف البكتيريا ، قم بالتخفيفات التسلسلية للوحة من التعليق البكتيري على ألواح TSB-agar ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية ثم إنشاء وحدات تشكيل المستعمرة البكتيرية ، CFUs من عدد المستعمرات. بالنسبة إلى المتصورة الزنجارية، يتوافق OD₆₀₀ من 1.0 مع 2 × 10⁸ خلايا بكتيرية قابلة للحياة / مل ، وبالنسبة ل L. monocytogenes ، فإن OD₆₀₀ من 1.0 يتوافق مع 9 × 10⁸ خلايا بكتيرية قابلة للحياة / مل.
5. احصد المزارع البكتيرية في المرحلة الأسية عن طريق الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم اغسلها مرة واحدة باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS 1 مل). أعد تعليق الكريات البكتيرية في 1 مل من 1x PBS وحدد التركيزات عن طريق قياس OD₆₀₀ من المعلقات البكتيرية. على سبيل المثال ، يمثل P. aeruginosa مع OD₆₀₀ من 0.5 تركيزا 1 × 10⁸ خلايا بكتيرية / مل.
6. قم بتلطيخ المعلق البكتيري باستخدام صبغة فلورية خضراء أو حمراء عند RT لمدة 30 دقيقة مع دوران لطيف في الظلام. لهذا الغرض ، أضف 2 ميكرولتر من صبغة تلطيخ المخزون المركزة بمقدار 500 ضعف إلى 1 مل من التعليق البكتيري لتخفيف الصبغة 1 ضعف. لغسل صبغة التلوين ، قم بالطرد المركزي للبكتيريا الملطخة عند 13,000 × جم لمدة دقيقتين وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 1x PBS ثلاث مرات.
   ملاحظه: إذا تم استخدام البكتيريا الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP-) ، وبروتين الفلورسنت الأحمر (RFP-) ، و mCherry- ، وما إلى ذلك) في التجربة ، فتخط خطوة التلوين البكتيرية هذه. P. aeruginosa الموسومة ب GFP و L. monocytogenes الملطخة بالصبغة الفلورية الحمراء تم استخدامها في هذا البروتوكول.
7. اجمع الخلايا البكتيرية الملطخة أو البكتيريا الموسومة ب GFP عن طريق الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة دقيقتين ، أعد تعليقها في وسط F-12K طازج (1 مل) وقم بقياس OD₆₀₀ لكل ثقافة. قم بتخفيف الثقافات بشكل لاحق إلى التركيزات المرغوبة بناء على تعدد العدوى (MOI) وتركيز الخلية المضيفة. الحجم النهائي المستخدم في هذه التجربة هو 500 ميكرولتر.
   ملاحظه: على سبيل المثال ، إذا كان تركيز الخلية المضيفة المحسوبة باستخدام تلطيخ Trypan Blue هو 1 × 10⁵ خلايا / مل ، فإن التركيز المطلوب للخلايا البكتيرية عند MOI 100 سيكون 1 × 10⁷ خلايا / مل. تركيز المتصورة الزنجارية عند 0.5 OD₆₀₀ هو 1 × 10⁸ / مل. للحصول على التركيز المطلوب ، قم بتخفيف مزرعة P. aeruginosa 10 أضعاف ، وأضف 50 ميكرولتر من المزرعة المعلقة إلى 450 ميكرولتر من وسط F-12K الطازج.

المواد