الكشف عن ارتباط الفيترونكتين بالأسطح البكتيرية باستخدام قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Singh ، B. et al. ، فحوصات لدراسة دور الفيترونكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل.J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو اكتشاف تفاعل vitronectin مع البروتينات السطحية البكتيرية. يقيس تحليل قياس التدفق الخلوي إشارة التألق للأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت المرتبطة بفيترونكتين ، مما يؤكد وجودها على سطح البكتيريا. توفر هذه التقنية رؤى حول تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض وعلاجات العدوى البكتيرية المحتملة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحليل Vitronectin ، Vn كبروتين سطحي بكتيري - ligand

1. الكشف عن ارتباط Vn على السطح البكتيري باستخدام قياس التدفق الخلوي
   ملاحظه: في قياس التدفق الخلوي ، استخدمنا التشتت الجانبي والتشتت الأمامي لبوابة الأحداث الإيجابية. لفحص التفاعلات مع Vn ، المستدمية النزلية من النوع f ، تم اختيار العزلات السريرية Hif (ن = 10) جنبا إلى جنب مع بكتريا قولونية BL21 (DE3) كعنصر تحكم سلبي (الشكل 1 أ).
   1. ثقافة Hif العزلات السريرية في وسط تسريب الدماغ والقلب (BHI) مكمل ب 10 ميكروغرام / مل من نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD) والهيمين عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. استخدم وسط لوريا بيرتاني لزراعة الإشريكية القولونية. حصاد Hif في منتصف مرحلة السجل (الكثافة البصرية ، OD₆₀₀ = 0.3) ، وإعادة تعليق البكتيريا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.2 ، التي تحتوي على 1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) (مانع المخزن المؤقت ؛ PBS-BSA). اضبط التعليق على 10⁹ وحدات تشكيل مستعمرة ، CFU / مل.
   2. انقل الحصص التي تحتوي على 5 × 10⁶ CFU إلى 5 مل من البوليسترين أنابيب مستديرة القاع (12 × 75 مم²) وأضف 1 مل من المخزن المؤقت للحظر. الطرد المركزي التعليق عند 3,500 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق لحبيبات البكتيريا ، ثم استنشق بعناية لإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
   3. أعد تعليق الكريات البكتيرية ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 250 نانومتر Vn واحتضان العينات لمدة 1 ساعة عند RT دون اهتزاز. بعد الحضانة ، قم بتقطيع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 3,500 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل الكريات ثلاث مرات باستخدام PBS وخطوات الطرد المركزي المماثلة.
   4. إلى الحبيبات البكتيرية ، أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للإنسان (pAbs) للأغنام الأولية عند تخفيف 1: 100 في PBS-BSA. احتضان المعلق لمدة 1 ساعة في RT ، ثم اغسل البكتيريا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة (كما هو موضح في الخطوة 1.1.3).
   5. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر من PBS-BSA الذي يحتوي على الحمار المترافق بالفلوريسئين (FITC) (1: 100 تخفيف) واحتضنه في RT لمدة ساعة واحدة في الظلام.
   6. قم بإعداد عنصر تحكم فارغ عن طريق احتضان البكتيريا مع مانع المخزن المؤقت فقط و pAbs بدون Vn.
   7. اغسل البكتيريا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت المانع وحبيبات التعليق بالطرد المركزي ، كما هو موضح في القسم 1.1.2. أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات البكتيرية ب 300 ميكرولتر من PBS وقم بتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: المستدمية النزلية النمط المصلي f يربط Vn عبر درجة الحموضة المعبر عنها على السطح.(أ) تظهر نتائج قياس التدفق الخلوي ارتباط Vn بخلايا عزلات Hif السريرية. تم تحضين كل عزلة سريرية (5 × 10⁶ CFU) ب 250 نانومتر Vn بشري. تم الكشف عن الترابط المرتبط باستخدام الأغنام المضادة ل Vn pAbs والأجسام المضادة الثانوية للحمار المترافق FITC. تم تضم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5 مل البوليسترين أنبوب دائري القاع بي دي فالكون 60819-138 نمط 12 × 75 مم ألبومينات مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 2058 مناسبة لزراعة الخلايا مقياس التدفق الخلوي BD Biosciences 651154 درجة تحليل الخلايا للتطبيقات البحثية فيترونكتين (Vn) من البلازما البشرية سيجما ألدريتش V8379-50UG درجة زراعة الخلية الإشريكية القولونية المضيف (الإشريكية القولونية BL21) نوفاجين 69450-3 مضيف تعبير البروتين الأجسام المضادة للحمار المترافق FITC المضادة للأغنام عبد العالي سيروتيك STAR88F متعدد النسيلة الأغنام المضادة للإنسان Vn عبد العالي سيروتيك أهب396 متعدد النسيلة