تقييم فسفرة البروتين داخل الخلايا الناجم عن السيتوكين اللحمي باستخدام القياس الخلوي لتدفق الفوسفو

الملخص

المصدر: Coats، J. S. ، et al. التعبير عن السيتوكين الخارجي في الطعوم الغريبة المشتقة من المريض عن طريق الحقن باستخدام خط الخلايا اللحمية المنقولة بالسيتوكين. J. Vis. Exp. (123) (2017).

يوضح هذا الفيديو تقييم الفسفرة داخل الخلايا التي يسببها السيتوكين اللحمي للبروتينات في خلايا سرطان الدم. يتم قياس هذه البروتينات الفسفرية داخل الخلايا باستخدام تقنية قياس التدفق الخلوي للفوسفو.

البروتوكول

1. فحوصات القياس الخلوي للتدفق الفوسفوري لتقييم نشاط السيتوكين الذي تنتجه ستروما

ملاحظة: قم بتقييم المادة الطافية من السدى المصمم هندسيا قبل التجربة الأولى للتحقق من النشاط الحيوي ذي الصلة للسيتوكين المتولد من السدى للتجربة الفردية. بمجرد التحقق من صحة السدى المصمم هندسيا ، لا يلزم إجراء مزيد من الاختبارات ما لم يتم إدخال السدى الذي تم إنتاجه بناقل جديد.

1. قم بشراء خطوط خلايا ابيضاض الدم MUTZ5 و / أو MHH-CALL4 (مستجيبة ل TSLP) ، والسيتوكينات البشرية المؤتلفة ، والأجسام المضادة المعتمدة للاستخدام في فحوصات قياس الخلايا بالتدفق الفوسفوري للكشف عن أهداف الفسفرة النهائية المناسبة.
2. ذوبان الجليد الطافي المحصود من السيترول والسدى الذي يعبر عن السيتوكينات.
3. ضع خطوط خلايا سرطان الدم في وسط R20 (انظر جدول المواد) بتركيز 0.2 × 10⁶ خلايا لكل بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 96 بئر. لوحة 3 آبار لكل حالة للسماح بإجراء فحوصات ثلاثية. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تسمح هذه المرة بفقدان أي فسفرة حدثت خلال ظروف الاستزراع السابقة.
   ملاحظة: توفر 12 بئرا لكل خط خلية فحوصات ثلاثية لكل حالة تجريبية موضحة في الخطوة 1.4.
4. بعد ساعتين في المزرعة ، انقل الخلايا من كل بئر لفصل أنابيب 4 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية.
   1. أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر لكل حالة من الحالات التجريبية التالية (قم بإجراء المقايسات في ثلاث نسخ): 1) وسائط التحكم السلبية فقط ، 2) وسائط التحكم الإيجابية مع السيتوكين المؤتلف عند تركيز (تركيزات) المشبع (TSLP عند 15 نانوغرام / مل ، إلخ) ، 3) التحكم في السدى الطافي من سدى التحكم ، و 4) السيتوكين - السدى الطافي من السدى المنتج للسيتوكين.
5. احتضان الخلايا للمدة المحددة بواسطة مقايسة فوسفو تجارية محددة (على سبيل المثال ، 30 دقيقة ل phospho-STAT5 في MUTZ5 أو MHH-CALL4 استجابة ل TSLP).
6. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وصب المادة الطافية.
7. قم بإجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي للفوسفو وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وجمع بيانات قياس التدفق الخلوي.
8. تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي.
   1. البوابة على الخلايا السليمة على أساس التشتت الخفيف إلى الأمام (FSC ، يشير إلى حجم الخلية) والجانب (SSC ، يشير إلى حبيبات الخلية).
   2. حدد متوسط شدة الفلورسنت (MFI) للخلايا السليمة في كل عينة. قارن متوسط MFI الذي تم الحصول عليه من القيم الثلاثية للطافي اللحمي بعناصر التحكم في الوسائط الإيجابية والسلبية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 10 مل ماصات مصلية صقر 357551 15 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين صياد 05-539-12 50 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين صقر 352098 1 مل أطراف ماصة صياد 2707509 أطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر دينفيل العلمية P3020-CPS 10 ميكرولتر أطراف ماصة دينفيل العلمية ف -1096-CP وسط زراعة الخلايا "R20" ، ٪ من الحجم الكلي (يصنع 195 مل) وصفة المختبر RPMI، 76.84٪ (150 مل) ميدياتك 10-040-السيرة الذاتية FBS، 20.49٪ (40 مل) ميدياتك 35-011-السيرة الذاتية 2 ملي ل-جلوتامين ، 1.02٪ (2 مل) ميدياتك 35-011-السيرة الذاتية 1 ملي بيروفات الصوديوم ، 1.02٪ (2 مل) البنسلين الستربتومايسين، 0.51٪ (1 مل ميدياتك 30-002-كلتر 2-ميركابتو إيثانول ، 0.10٪ (0.1 م) ، 0.10٪ (200 ميكرولتر) النائب 190242 البيولوجيا خط خلية "CALL-4" MHH-CALL-4 ، ابيضاض الدم السلائف للخلايا البائية البشرية DSMZ لجنة التنسيق الإدارية 337 خط خلايا MUTZ-5 ، ابيضاض الدم السلائف للخلايا البائية البشرية DSMZ ACC 490 بروتين TSLP البشري المؤتلف أنظمة البحث والتطوير 1398-TS-010 الأجسام المضادة للتدفق الخلوي (استنساخ) * مضاد للفأر CD45 FITC (30F11) ميلتيني بيوتيك 130-102-778 CD127 PE (MB15-18C9) (الاسم البديل هو IL-7Rα) ميلتيني بيوتيك 130-098-094 CD34 APC (8G12) BD Biosciences 340667 CD45 PE-Cy7 (HI30) العلوم البيولوجية الإلكترونية 25-0459 "FVD" صبغة قابلة للإصلاح eFluor 780 العلوم البيولوجية الإلكترونية 65-0865 سلسلة Ig κ الخفيفة FITC (G20-193) BD Pharmingen 555791 سلسلة Ig λ الخفيفة FITC (JDC-12) BD Pharmingen 561379 IgD PE (IA6-2) بيو ليجند 348203 IgM PE-Cy5 (G20-127) BD Biosciences 551079 pSTAT5 PE، ماوس مضاد ل STAT5 (pY694) BD PhosphoFlow 612567 مواد ومعدات أخرى برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي FlowJo فلولجو ، ذ م م الإصدار 10 * جميع الأجسام المضادة مضادة للإنسان ما لم ينص على خلاف ذلك.