تصور البكتيريا في أقسام خزعة المثانة عن طريق التهجين الموضعي الفلوري

الملخص

المصدر: Neugent، M. L. et al.، الكشف عن البكتيريا المقيمة في الأنسجة في خزعات المثانة عن طريق 16S rRNA Fluorescence في التهجين الموضعيJ. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تصور البكتيريا في أنسجة المثانة منزوعة البارافين من مريض مصاب بالمسالك البولية. يكشف المسبار المسمى بالفلورسنت المهجن مع الحمض النووي الريبي الريبوزومي البكتيري 16s عن البكتيريا المرتبطة بالأنسجة وتوزيعها ، مما يوفر رؤى مكانية قيمة حول كثافتها داخل العينة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الأنسجة للتثبيت وتضمين البارافين

ملاحظة: تم أخذ الخزعات من النساء الموافقات اللواتي خضعن لتنظير المثانة مع الإشباع الكهربائي لالتهاب المثلث الشعري للإدارة المتقدمة لعدوى المسالك البولية المتكررة (rUTI). يعرف التهاب المسالك البولية على أنه 3 التهابات المسالك البولية في 12 شهرا. تم إجراء جمع الخزعة في غرفة العمليات بينما كان المريض تحت التخدير بعد الحصول على موافقة المريض المستنيرة. تم ترميز جميع العينات وإلغاء تحديدها قبل التجريب.

1. احصل على خزعة كوب بارد (~ 1 مم³) من المثانة الثلاثي باستخدام ملقط المسالك البولية عبر منظار المثانة المرن وضعه على الفور في كريوفيال معقم سعة 2 مل يحتوي على 1.5 مل من 4٪ حجم / حجم بارافورمالديهايد (PFA) المحضر في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
   ملاحظة: يمكن صنع 4٪ PFA في 1x PBS مسبقا وتخزينها عند -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
2. إصلاح الخزعة لمدة 6 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو لمدة 16-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يجب حساب مدة التثبيت بناء على حجم عينة الأنسجة ويجب تجنب الإفراط في التثبيت. لا ينصح باستخدام الجلوتارالديهايد كمثبت لأنه يقدم التألق الذاتي.
3. في غطاء معقم أو خزانة سلامة حيوية ، قم بإزالة المثبت عن طريق سحب العينة واستبدله ب 1.5 مل من محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS). احتفظ بالعينات عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو قم بإجراء معالجة الأنسجة وتضمين البارافين على الفور.
4. استخدم ميكروتوما معقما لتقسيم كتل الأنسجة بسمك 5 ميكرومتر ولصق أقسام أنسجة البارافين بشرائح المجهر الزجاجي المشحون. ستكون هناك حاجة إلى شريحتين على الأقل لكل خزعة لبروتوكول التهجين الموضعي (FISH) 16S RNA الريبوزومي (16S rRNA><). ملاحظة: يجب ترتيب أنسجة الخزعة بشكل مقطعي بالنسبة لمستوى القطع من أجل ضمان تصور طبقات الظهارة البولية في جميع الأقسام. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه يجب تحسين سمك المقطع للكشف عن المجتمع البكتيري. قد تكون هناك حاجة إلى أقسام أرق أو أخذ عينات من أقسام تسلسلية متعددة في حالة العدوى التي تكون فيها البكتيريا المقيمة في الأنسجة نادرة للغاية (على سبيل المثال ، <1 بكتيريا مقيمة في الأنسجة لكل 1000 خلية ثدييات).

فئة

2. التهجين الفلوري في الموقع مع مجسات عالمية 16S rRNA

ملاحظة: مطلوب شريحتان لكل خزعة. هناك حاجة إلى شريحة واحدة لمسبار 16S rRNA العالمي وشريحة واحدة لمسبار تحكم بتسلسل مشوش. هذا مهم لتمييز الإشارة الحقيقية عن إشارة الخلفية أثناء الفحص المجهري لأن ظهارة المثانة ذاتية الفلورسنت في قنوات متعددة. بالإضافة إلى مسبار التدافع ، قد يؤدي الحظر باستخدام 0.1٪ Sudan Black B قبل التركيب إلى تقليل التألق الذاتي في الخلفية المتأصل في الأنسجة.

1. تحضير الكواشف وغطاء الدخان
   1. نظف غطاء الدخان الفارغ (أو خزانة السلامة الحيوية المجهزة بشكل مناسب) بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   2. تحضير المخزن المؤقت للتهجين المكون من 0.9 مولار كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 20 ملي مولار تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.2) ، 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) في 10 مل من الماء المصفى المعقم. < / > ملاحظة: يمكن تحضير المياه المعقمة المفلترة عن طريق تمرير الماء المقطر المعقم عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. يمكن تخزين المخزن المؤقت للتهجين في درجة حرارة الغرفة ، ولكن قد يترسب SDS من المحلول. إذا ترسب SDS ، قم بتسخين المحلول في حمام مائي 50 درجة مئوية قبل الاستخدام.
   3. قم بإعداد ما لا يقل عن 100 مل لكل من 95٪ و 90٪ من الإيثانول في ماء مفلتر معقم في زجاجات مغسولة ومعقمة معقمة.
   4. قم بإذابة المجسات المجففة بالتجميد المسمى بالفلورسنت في 10 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) و 1 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) المحضرة في ماء خال من النوكلياز المعقم بالترشيح إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر. قم بإعداد تخفيف 1 ميكرومتر في المخزن المؤقت TE لاستخدامه في هذا البروتوكول. قم بتخزين كل من المرق المركز 100 ميكرومتر والمجسات المعاد تكوينها 1 ميكرومتر عند -20 درجة مئوية محمية من الضوء. < / > ملاحظة: لا تقم بإذابة المجسات ذات العلامات الفلورية في الماء. التخزين المؤقت مطلوب لمنع التحلل المائي لرابطة إستر N-hydroxysuccinimide (NHS) التي ترافق الفلوروفور بمسبار النيوكليوتيدات.
   5. نظف خمسة برطمانات كوبلين تحتوي على 70٪ إيثانول (EtOH) ، واتركها حتى تجف ، وقم بتسمية ما يلي: الزيلين الأول ، الزيلين الثاني ، 95٪ EtOH ، 90٪ EtOH ، الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) ، واملأه ب 100 مل من المحلول المناسب. سيساعد هذا في تجنب الارتباك في الخطوات اللاحقة.
2. إزالة البارافين من الأنسجة وإعادة الجفاف
   1. في الغطاء ، ضع شريحتين لكل خزعة في رف منزلق عمودي.
   2. ضع رفا منزلقا عموديا في جرة الزيلين I Coplin (تحتوي على 100 مل من الزيلينات) لمدة 10 دقائق.
   3. قم بإزالة رف الشرائح من الزيلين الأول وامسح الجزء السفلي على منشفة ورقية لإزالة الزيلين الزائد. ضعها في برطمان الزيلين II Coplin لمدة 10 دقائق
      ملاحظة: لا تعمل أبدا مع الزيلين خارج غطاء الدخان المعتمد.
   4. أعد ترطيب أقسام الأنسجة منزوعة البرافين في غسلات الإيثانول المتتالية (95٪ و 90٪) لمدة 10 دقائق لكل منها في برطمانات كوبلن المسماة على التوالي.
      ملاحظة: خلال هذه المرحلة ، قم بتسخين عازلة التهجين إلى 50-56 درجة مئوية في حمام مائي.
   5. قم بإزالة رف الانزلاق من غسول الإيثانول بنسبة 90٪ ، وامسح الجزء السفلي على مناشف ورقية لإزالة الإيثانول الزائد ، وضعه في وعاء ddH₂O Coplin الذي يحتوي على 100 مل من ddH₂O المعقم بالفلتر لمدة 10 دقائق.
   6. أثناء انتظار غسل ddH₂O ، قم بتخفيف المجسات إلى 10 نانومتر في مخزن مؤقت للتهجين لإنشاء محلول تلطيخ. تحضير 150 ميكرولتر من محلول التلوين لكل شريحة. < / > ملاحظة: قم بحماية محلول التلوين من الضوء عن طريق لف الأنابيب بورق الألمنيوم وتخزينها في درج. عند العمل مع مجسات تحمل علامة فلورسنت على سطح الطاولة ، ضع في اعتبارك إطفاء الأضواء العلوية عندما يكون ذلك ممكنا. لا ينبغي إعادة استخدام المجسات المخففة في المخزن المؤقت للتهجين.
3. التهجين والتلوين المضاد
   1. قم بإعداد غرفة ترطيب لكل مسبار عن طريق وضع الكيمواي المنقوع والمكسور والماء المعقم في خزان صندوق الأطراف P1000. ضع خرطوشة حامل الطرف في الأعلى - هذا هو المكان الذي ستجلس فيه الشرائح.
      ملاحظة: من المهم استخدام غرفة ترطيب لمنع أقسام الخزعة من الجفاف أثناء التهجين. وتجدر الإشارة إلى أن غرف الترطيب المتوفرة تجاريا مصممة للحفاظ على جو مستقر ورطب. ومع ذلك ، فإن التقنية المفصلة هنا تتحكم بشكل كاف في الرطوبة بتكلفة أقل بكثير.
   2. قم بإزالة الشرائح من رف الشرائح وضعها على منشفة ورقية جديدة (جانب المناديل لأعلى). استخدم Kimwipe لتجفيف الشريحة. احرص على التربيت برفق فقط بالقرب من قسم الخزعة (وليس على) لامتصاص الماء. باستخدام قلم مسعور ، ارسم حدا حول قسم الخزعة وضع جانب الأنسجة المنزلقة لأعلى في غرفة الترطيب. < / > ملاحظة: اعمل بسرعة حتى لا تجف الأنسجة قبل التهجين.
   3. ضع حجرة الترطيب في حاضنة مضبوطة على 50 درجة مئوية. الماصة 50-150 ميكرولتر من محلول التلوين مباشرة فوق الأنسجة بحيث يتم ملء المستطيل الذي يصنعه الحدود الكارهة للماء حول الأنسجة. احرص على عدم إضافة الكثير من المحلول لتجاوز الحدود الكارهة للماء. أغلق الصندوق برفق.
   4. احتضن بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) عند 50 درجة مئوية في الظلام. إذا كانت الحاضنة تحتوي على نافذة ، فقم بتغطيتها بورق الألمنيوم لخلق بيئة مظلمة.
      ملاحظة: مطلوب درجة حرارة تهجين أقل من درجة حرارة انصهار مسبار FISH للحصول على إشارة موثوقة. 50 درجة مئوية هي درجة الحرارة المثلى لمسبار الرنا الريبي العالمي 16S ولكنها قد لا تكون مثالية للمجسات الأخرى.
   5. في صباح اليوم التالي ، قم بإعداد ما لا يقل عن 500 مل من محلول الغسيل المكون من 0.9 مولار من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 20 ملي من Tris-HCl (درجة الحموضة 7.2) في ddH₂O وقم بتعقيمها في زجاجة معقمة باستخدام مرشح زجاجة مفرغ من الزجاجة. يسخن إلى 50-56 درجة مئوية في حمام مائي.
   6. قم بإزالة الشرائح من غرف الترطيب وتخلص بعناية من أي محلول تهجين متبقي باستخدام Kimwipe. ضع الشرائح في رف تلطيخ عمودي.
   7. ضع رف التلوين في وعاء كوبلين غير شفاف يحتوي على 100 مل من محلول الغسيل المسخن مسبقا لمدة 10 دقائق. إذا لم تكن برطمانات كوبلين معتمة (على سبيل المثال ، الزجاج) ، ضعها في الظلام أثناء خطوات الحضانة - ربما تحت صندوق أو في درج.
   8. كرر خطوة الغسيل مرتين باستخدام محلول غسيل طازج في برطمانات كوبلين الجديدة.
   9. أثناء خطوات الغسيل ، قم بإعداد البقعة المضادة عن طريق تخفيف محلول مخزون 100 ميكروغرام / مل من Hoechst 33342 1: 1,000 في مخزن الغسيل. إلى نفس الأنبوب ، أضف Alexa-555 جنين القمح agglutinin (WGA) إلى التركيز النهائي البالغ 5 ميكروغرام / مل و Alexa-555 Phalloidin إلى التركيز النهائي البالغ 33 نانومتر. يحفظ في الظلام حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
      ملاحظة: Hoechst و Alexa-555 WGA و Alexa-555 Phalloidin ملصق حمض الديوكسي ريبونوكلييك (DNA) ، والموسين / اليوروبالكينز ، والأكتين ، على التوالي ، ويمكن تخزينها على المدى الطويل في الظلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن تخصيص ملصقات الفلورسنت المستخدمة في المجسات والبقع المضادة لمجموعات المرشحات المتاحة للمجهر المراد استخدامه.
   10. قم بإزالة الشرائح من الغسيل الأخير وتخلص برفق من مخزن الغسيل الزائد باستخدام Kimwipe. ضع جانب الشرائح على جانب المنديل لأعلى على منشفة ورقية وأضف 50-150 ميكرولتر من البقعة المضادة مباشرة فوق الأنسجة بحيث تمتلئ الحدود الكارهة للماء ، ولكن لا تفيض. قم بتغطية ما يصل إلى أربع شرائح بسطح صندوق التبريد واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   11. ضع الجوانب مرة أخرى في رف التلوين واغسلها مرتين أخريين في برطمانات كوبلين مع محلول غسيل طازج ، لمدة 10 دقائق لكل منهما.
   12. جفف الشرائح جيدا بعد الغسيل الأخير وضع جانب المناديل لأعلى على منشفة ورقية أسفل سطح صندوق التبريد. اضغط على قطرة واحدة من وسائط التثبيت مباشرة فوق المنديل. ضع غطاء بحجم مناسب برفق (يعتمد على حجم الخزعة) في الأعلى. اضغط برفق على أي فقاعات لأنها ستتداخل مع التصوير وتسمح للشرائح المنزلقة بالغطاء بالشفاء طوال الليل في الظلام.
   13. في اليوم التالي ، أغلق حواف الغطاء على الشريحة بطبقة خفيفة من طلاء الأظافر الشفاف. اتركيه ليجف لمدة 10 دقائق في الظلام ثم خزنيه في الظلام عند 4 درجات مئوية للفحص المجهري متحد البؤر.

< p class = "jove_title" >3. تصور 16S rna FISH بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر

ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم تحقيق أفضل النتائج باستخدام مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر بأهداف 63x و 100x. مطلوب مجموعات مرشحات مناسبة لتصور مضان Hoechst و Alexa-488 و Alexa-555. ومع ذلك ، يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري القياسي في حالة عدم توفر المجهر متحد البؤر. هذا البروتوكول مخصص لمجهر متحد البؤر للمسح بالليزر.

1. قم بتشغيل المجهر متحد البؤر وبرنامج الكمبيوتر المرتبط بالمجهر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. قم بتحميل الشريحة وتصور مع الهدف 10x في القناة الزرقاء (Hoechst). ركز بعناية حتى تظهر النوى.
3. بمجرد التركيز ، قم بتغيير الهدف إلى تكبير عال (63x أو 100x). أضف الزيت فوق الغطاء. أعد التركيز بالهدف الجديد ، وتأكد من أن العدسة الموضوعية تتلامس مع الزيت أثناء التركيز البؤري.
   ملاحظة: استخدم التركيز البؤري الدقيق فقط عند التكبير العالي (63x أو 100x). يجب استخدام الزيت فقط لهدف النفط.
4. قم بتقييم كل شريحة بسرعة من خلال قطعة العين في القناة الخضراء (بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن ، eGFP / Alexa-488) لتحديد الشرائح الإيجابية للأسماك وأيها سلبية FISH.
   ملاحظة: من الأفضل أن يتم إجراء هذا التقييم / التسجيل الأولي أعمى من قبل فرد منفصل لتقليل التحيز التجريبي.
5. لتصوير الخزعات الملطخة ، ابدأ بشريحة إيجابية FISH وانتقل إلى وضع تصور الكمبيوتر. حدد القنوات 405 (Hoechst) و 488 (Alexa-488) و 555 (Alexa-555). اضبط الثقب باستخدام أطول قناة ذات طول موجي ، في هذه الحالة 555. أوجد المستوى البؤري الصحيح لتصور البكتيريا المصنفة في القناة 488. بدون تغيير المستوى البؤري ، اضبط الكسب وطاقة الليزر والإزاحة لكل قناة بحيث لا تكون الإشارة مشبعة ، ولا يتم تصحيح الخلفية بشكل مفرط. احصل على الصورة في جميع القنوات الثلاث.
   ملاحظة: استخدم نفس الإعدادات للقناة 488 لتصوير كل شريحة في التجربة. قد تتطلب طاقة الليزر تعديلا في القنوات 405 و 555 إذا تغير المستوى البؤري الأمثل للتصور البكتيري بين المجالات.

المواد