تقنية في المختبر لتوليد الخلايا التائية موت الخلايا المبرمج بوساطة الأشعة فوق البنفسجية

الملخص

المصدر: Hodge ، M. X. ، et al. في الجسم الحي تقييم كثرة الخلايا البؤرية السنخية بعد التعرض للأوزون. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة للحث على موت الخلايا المبرمج في خلايا جوركات - وهي خط خلايا ابيضاض الدم البشري للخلايا الليمفاوية التائية. تتعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية C (UVC) ، مما يتسبب في تلف الحمض النووي بشكل كبير ويؤدي إلى موت الخلايا المبرمجة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير خط الخلايا التائية Jurkat (اليوم 2)

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

1. زراعة الخلايا التائية Jurkat في 24 مل من وسط زراعة الخلايا القاعدية + 10٪ FBS + 5٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ (جدول المواد). خلايا Jurkat T عبارة عن خط خلوي معلق يمكن الحفاظ عليه من خلال المرور 1: 6-1: 8 إلى وسائط زراعة مدفأة مسبقا كل 3 أيام. لا تهز.
2. لتحضير الخلايا المبرمج ، قم بزراعتها إلى 90٪ من التقاء كل قارورة (والتي تستغرق 3-4 أيام لتحقيقها بعد المرور). في هذه الدراسة ، استخدم خلايا من خمسة قوارير T75 للحصول على عدد كاف من الخلايا المستخدمة في هذا ><البروتوكول. ملاحظه: تحتوي القارورة المتجمعة على حوالي 20-24 مليون خلية.
3. قم برفع الخلايا (وهي القارورة بأكملها) من كل قارورة (حوالي 24 مل) ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية. استخدم أنابيب مخروطية متعددة للقوارير المتعددة.
4. عد الخلايا عن طريق إزالة 11 ميكرولتر من الخلايا من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل وخلطها مع 11 ميكرولتر من صبغة التريبان الزرقاء والماصة 11 ميكرولتر على شرائح مقياس الدم.
5. أدخل الشريحة في عداد الخلايا الآلي وسجل عدد الخلايا الحية لحساب إجمالي عدد الخلايا في كل قارورة بضرب عدد الخلايا الحية في 24 ، حيث تحتوي كل قارورة على 24 مل من الوسائط.
6. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 271 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لخلايا الحبيبات.
7. تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط وأعد تعليق حبيبات الخلية في الوسائط للحصول على 3.0 × 10⁶ خلايا لكل مل.
8. Aliquot 5 مل من الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة 100 مم × 20 مم (سيتم استخدام ما يقرب من تسعة أطباق ؛ يجب أن تكون الكمية الإجمالية للخلايا في كل طبق ~ 15 × 10⁶).
9. استخدم طبقا واحدا للتحكم / غير المكشوف ، وستتعرض الأطباق المتبقية للأشعة فوق البنفسجية.
10. اضبط الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية على مستوى الطاقة الصحيح ، واضغط على زر الطاقة ، وأدخل "600" باستخدام لوحة الأرقام ، والتي ستقرأها الماكينة على أنها 600 ميكروجول / سم² × 100.< br / > ملاحظه: وحدات طاقة الوصلة الشابكة للأشعة فوق البنفسجية في μJ / cm² × 100 ؛ لذلك ، لتحقيق 60 مللي جول / سم² ، قم بتحويل الوحدات لتتناسب مع الوصلة العريضة للأشعة فوق البنفسجية.
11. قم بإشعاع جميع الأطباق بالخلايا ، باستثناء عنصر التحكم ، عند 60 مللي جول (مللي جول) / سم² باستخدام الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية. قم بإزالة الغطاء العلوي لأطباق زراعة الأنسجة أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، لأن ضوء الأشعة فوق البنفسجية لن يخترق الغطاء البلاستيكي.
12. احتضان جميع الأطباق في حاضنة زراعة الخلايا ، بما في ذلك التحكم غير المكشوف ، عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 ساعات.
13. تأكد من موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام مجموعة الكشف عن مقايسة موت الخلايا المبرمج التي تحتوي على الملحق V ويوديد البروبيديوم (PI) (علامات موت الخلايا المبرمج والنخر ، على التوالي) بعد 4 ساعات من الحضانة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظه: سيؤدي تشعيع خلايا Jurkat T في الوصلة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية بمستوى طاقة 600 ميكروجول / سم² ، بعد حضانة لمدة 4 ساعات ، إلى ≥75٪ من الخلايا المبرمجة (المبكرة والمتأخرة) التي تحتوي على نمط ظاهري موت الخلايا المبرمج المبكر أكثر من النمط الظاهري المبرمج المتأخر. هذا يجعل من السهل على البلاعم السنخية التعرف عليها وابتلاعها لأن أغشيتها لا تقبل أي منزعزع ، على عكس الخلايا المبرمجة المتأخرة ، مما يؤدي إلى ارتفاع مؤشر الخلايا الفعلي وتصوير أكثر دقة لكثرة البلاعم السنخية في هذه الدراسة.
    1. تجمع 333 ميكرولتر (1 × 10⁶ خلايا) من خلايا Jurkat T من عدة أطباق ("بدون أشعة فوق البنفسجية" و "المعرضة للأشعة فوق البنفسجية") معا لاستخدامها في أنابيب تحليل التعويض.
    2. Aliquot 333 ميكرولتر من خلايا Jurkat T في صبغة واحدة غير ملوثة ، ملحقة V ، بقعة مفردة PI ، لا تحكم في الأشعة فوق البنفسجية ، و 600 ميكروجول / سم² أنابيب قياس التدفق الخلوي المعرضة للأشعة فوق البنفسجية.
    3. أنابيب الطرد المركزي عند 188 × جم لمدة 5 دقائق في RT وصب المادة الطافية.
    4. اغسل الخلايا عن طريق التعليق في 500 ميكرولتر من محلول ملحي بارد 1x مخزن بالفوسفات (PBS).
    أجهزة
    5. الطرد المركزي وخلايا الحبيبات عند 188 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي.
    6. قم بإعداد 400 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت ملزم لكل أنبوب تدفق عن طريق تخفيف 10x مخزن مؤقت ملزم بالماء المقطر أثناء قيام الخلايا بالطرد المركزي.
    7. قم بإعداد كاشف حضانة الملحق V و PI (100 ميكرولتر لكل عينة / أنبوب) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    8. صب المادة الطافية بعد الطرد المركزي وإعادة تعليق جميع الأنابيب برفق في 400 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت ربط ، ثم أضف 100 ميكرولتر من كاشف حضانة الملحق V إلى كل أنبوب عينة. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من صبغة واحدة من الملحق V وصمة عار مفردة PI إلى الأنابيب الخاصة بها ، ولكن لا تضيف أي شيء يتجاوز المخزن المؤقت الملزم 1x إلى الأنبوب غير الملطخ.
    9. احتضان الأنابيب في الظلام لمدة 15 دقيقة في RT.
    10. جهاز الطرد المركزي جميع الخلايا عند 188 × جم لمدة 5 دقائق في RT وصب الطافف.
    11. أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من مخزن مؤقت ربط 1x ، ثم قم بتحليل عينات موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي. اجمع ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل أنبوب للسماح بتمثيل دقيق للتلطيخ.
14. اجمع جميع الخلايا المشعة من الأطباق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي عند 271 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
15. تخلص من المادة الطافية من الأنبوب عن طريق الشفط وأعد تعليق الخلايا في 24 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) وخلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 271 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
16. تخلص من المادة الطافية من الأنبوب عن طريق الشفط وأعد تعليق الخلايا بكمية PBS المستخدمة في جرعات الفئران المعتمدة من قبل IACUC. الجرعة المستخدمة بين 5-10 × 10⁶ خلايا / 50 ميكرولتر لكل فأر. لذلك ، بالنسبة ل 10 فئران ، أعد التعليق في 500 ميكرولتر (يختلف عدد الخلايا في كل جرعة اعتمادا على عدد الخلايا التي يتم زراعتها للإشعاع).
    ملاحظه: قم بعمل جرعتين إضافيتين على الأقل لحساب أي سائل قد يلتصق بجوانب طرف الماصة مما يؤدي إلى فقدان الخلايا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الملحق V-FITC Kit تريفيجن 4830-250-ك تسمح مجموعة TACS Annexin V-FITC بتحديد سريع ومحدد, وكمية موت الخلايا المبرمج في الخلايا الفردية عند استخدام قياس التدفق الخلوي. BCL2 Jurkat الخلايا التائية ATCC ATCC CRL-2899 تم اشتقاق خط خلية BCL2 Jurkat عن طريق نقل خلايا Jurkat T البشرية باستخدام ناقل تعبير الثدييات pSFFV-neo الذي يحتوي على إدراج BCL-2 ORF البشري وجين مقاوم للنيومايسين. كان لنماذج قياس كثرة اليدوية. عداد الخلايا الآلي للكونتيسة الثانية ثيرموفيشر AMQAX1000 إنها منصة فحص منضدية مجهزة بأحدث البصريات والتركيز التلقائي الكامل وبرنامج تحليل الصور للتقييم السريع للخلايا المعلقة. سهل الاستخدام جدا. Cytospin 4 جهاز الطرد المركزي الخلوي ثيرموفيشر A78300003 يوفر مستحضرات طبقة رقيقة اقتصادية من أي مصفوفة سائلة ، وخاصة السوائل تحت الخلايا مثل سائل غسيل القصبات الهوائية. مصل الأبقار الجنينية، مؤهل، معطل بالحرارة ثيرموفيشر 16140071 يوفر العناصر الغذائية للخلايا المستنبتة لنموها. إنه معيار لزراعة الخلايا. البنسلين - ستربتومايسين سيجما / ألدريتش P0781-100 مل البنسلين الستربتومايسين هو محلول المضادات الحيوية الأكثر استخداما لزراعة خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدامه للحفاظ على الظروف المعقمة أثناء زراعة الخلايا. RPMI 1640 متوسط، مكمل غذائي GlutaMAX ثيرموفيشر 61870036 تم تطوير RPMI 1640 Medium (معهد روزويل بارك التذكاري 1640 Medium) في الأصل لزراعة خلايا سرطان الدم البشرية في معلق وكطبقة أحادية. منذ ذلك الحين ، تم العثور على وسيط RPMI 1640 مناسبا لمجموعة متنوعة من خلايا الثدييات ، بما في ذلك HeLa و Jurkat و MCF-7 و PC12 و PBMC والخلايا النجمية والأورام السرطانية. يساعد على نمو خلايا Jurkat T بسرعة وكفاءة. ستراتاجين للأشعة فوق البنفسجية ستراتالينكر 1800 الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker كامبريدج العلمية 16659 تم تصميم أداة الربط المتشابك للأشعة فوق البنفسجية ستراتالينكر للحث على موت الخلايا المبرمج أو الحمض النووي المتشابك أو الحمض النووي الريبي إلى أغشية النايلون أو النيتروسليلوز أو النايلون المقوى.