تحليل التنشيط القاعدي في وجود اختبار مسببات الحساسية باستخدام قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Doña، I. et al.، اختبار تنشيط القاعدي لتشخيص الحساسية. J. Vis. Exp. (2021)

في هذا الفيديو ، نوضح اختبار تقييم تنشيط القاعدية في وجود اختبار مسببات الحساسية باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة

1. اجمع الدم المحيطي في أنابيب هيبارين سعة 9 مل وحافظ على العينة في درجة حرارة الغرفة (RT) في الدوار حتى تصبح مطلوبة للبروتوكول التجريبي.
2. قم بتسمية أنابيب مقياس الخلوي سعة 5 مل للعناصر السلبية (أنبوبتان) ، والضوابط الإيجابية (أنبوبتان) ، وتركيزات مختلفة من مسببات الحساسية / الدواء (أنبوب واحد لكل تركيز مسببات الحساسية / الدواء تم اختباره). ضع الأنابيب في رف حيث تتناسب الأنابيب تماما دون الانزلاق.
3. تحضير مخزن مؤقت للتحفيز في ماء مقطر مزدوج يحتوي على 2٪ (حجم / حجم) HEPES ، 78 مجم / لتر كلوريد الصوديوم ، 3.7 مجم / لتر كلوريد كلوريد الصوديوم ، 7.8 مجم / لتر كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 3.3 مجم / لتر MgCl₂ ، 1 جم / لتر HSA. اضبط درجة الحموضة على 7.4 وأضف IL-3 عند 2 نانوغرام / مل. عادة ، قم بإعداد 100 مل وقسمها إلى 2.5 مل ليتم تجميدها عند -20 درجة مئوية.
4. إعداد ضوابط إيجابية في PBS-Tween-20 0.05٪ (v / v) (PBS-T): التحكم الإيجابي 1 ، N-Formyl methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (4 μM) ، لتأكيد جودة الخلايا القاعدية ؛ التحكم الإيجابي 2 ، Anti-IgE (0.05 مجم / مل) كتحكم إيجابي بوساطة IgE.
5. تحضير مسببات الحساسية / الدواء في PBS-T بمعدل 2x التركيز النهائي المطلوب.
   ملاحظه: يجب تحديد تركيزات مسببات الحساسية / الأدوية المثلى التي سيتم استخدامها مسبقا باستخدام مجموعة واسعة من التركيزات ، ومنحنيات استجابة الجرعة ، ودراسات السمية الخلوية باتباع نفس خطوات البروتوكول.

< p class = "jove_title" >2. تحضير خليط التلوين

1. أضف الأجسام المضادة أحادية النسيلة المسماة بالفلوروكروم إلى المخزن المؤقت للتحفيز بعد تركيز الجسم المضاد الموصى به من قبل الشركة المصنعة أو عن طريق معايرة الأجسام المضادة السابقة. في هذا البروتوكول ، نضيف 1 ميكرولتر من كل جسم مضاد (CCR3-APC و CD203c-PE لتحديد القاعدة. CD63-FITC لتنشيط القاعدة) لكل 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحفيز.
   ملاحظه: حماية تحضير مزيج التلوين من الضوء.
2. أضف 23 ميكرولتر من مزيج التلوين إلى كل أنبوب.

فئة

3. تحفيز الدم

1. أضف 100 ميكرولتر من PBS-T إلى الأنبوبين 1 و 2 (التحكم السلبي) ، و 100 ميكرولتر من fMLP إلى الأنبوب 3 ، و 100 ميكرولتر من مضاد IgE إلى الأنبوب 4 ، و 100 ميكرولتر من تركيزات مسببات الحساسية / الأدوية المختلفة إلى الأنابيب التالية. احتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حمام ثرموستاتي مع تقليب متوسط لتسخين الكواشف.
2. أضف 100 ميكرولتر من الدم برفق إلى كل أنبوب لتجنب انحلال الدم. قم بتحريك أنابيب الدوامة برفق واحتضانها لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام ثرموستاتي مع تحريك متوسط.
3. أوقف التحلل ، واحتفظ بالأنابيب عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل < / > ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا عند 4 درجات مئوية لمدة 30-45 دقيقة إذا لزم الأمر.

< p class = "jove_title" >4. تحلل كريات الدم الحمراء

1. أضف 2 مل من محلول التحلل 1x إلى كل أنبوب لتحلل كريات الدم الحمراء. دوامة كل أنبوب واحتضانها لمدة 5 دقائق في RT.
   ملاحظه: في هذه الخطوة ، يتم إصلاح الخلايا بسبب عوامل التثبيت (الفورمالديهايد) الموجودة في المخزن المؤقت.
2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية ، وقلب الرف في حوض. تبقى الخلايا في أسفل الأنابيب.
3. أضف 3 مل من PBS-T إلى كل أنبوب لغسل الخلايا. دوامة كل أنبوب.
4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. صب المادة الطافية ، وقلب الرف في حوض.
   ملاحظه: احتفظ بالعينات عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء حتى الحصول على مقياس التدفق الخلوي.

فئة

5. اكتساب قياس التدفق الخلوي

1. احصل على عينات عن طريق مقياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال ، مقياس التدفق الخلوي BD FACSCalibur). قم بتوصيل مقياس التدفق الخلوي ببرنامج الكمبيوتر وانتظر حتى يصبح مقياس المدار الخلوي جاهزا. قم بتحميل إعدادات القالب والجهاز (الجدول 1).
2. ابدأ الحصول على العينة.
3. استخدم استراتيجيات مقياس الخلايا التالية لاختيار الخلايا القاعدية المنشطة.
   1. قم ببوابة الخلايا الليمفاوية من مخطط التشتت الجانبي (SSC) - التشتت الأمامي (FSC).
   2. افصل الخلايا القاعدية من خلايا الخلايا الليمفاوية كخلايا CCR3 ⁺ CD203c ⁺. احصل على ما لا يقل عن 500 قاعدية لكل أنبوب.
   3. إظهار مخطط CCR3 - CD63 لتحليل التنشيط باستخدام CD63 كعلامة تنشيط. اضبط العتبة السلبية CD63 على حوالي 2.5٪ باستخدام أنابيب التحكم السلبية.
   4. الحصول على جميع العينات.

الجدول 1: متطلبات مقياس التدفق الخلوي

مصادر الضوء (الليزر) 488 نانومتر ليزر أرجون أيون متماسك SapphireTM ؛ 20 ميغاواط ؛ 633 نانومتر JDS UniphaseTM HeNe ليزر مبرد بالهواء ؛ 17 ميغاواط الطول الموجي الضوئي الضوئي الليزر الأزرق: 488 نانومتر ؛ الليزر الأحمر: 633 نانومتر مصدر الضوء الطاقة عند الطول الموجي المثير الليزر الأزرق: 20 ميغاواط ؛ ليزر أحمر: 17 ميجاوات المرشحات البصرية SSC: 488/10; FITC: 530/30 ، PE: 585/42 ، APC: 660/20 أجهزة الكشف الضوئية FSC ، SSC ، FL1-H FITC ، FL2-H PE ، FL4-H APC أجهزة الكشف الضوئية ليزر أرجون أيون مبرد بالهواء المسارات البصرية BD مثمن (خط ليزر 488 نانومتر) ؛ BD Trigons (خط ليزر 633 نانومتر)

المواد