تتبع الكريات البيض القائمة على التحويل الضوئي في أسماك الزرد المعدلة وراثيا المصابة بالبكتيريا

الملخص

المصدر: Harvie، E. A. et al.، التصوير غير الجراحي للاستجابة المناعية الفطرية في نموذج يرقات الزرد لعدوى المكورات العقدية الصغيرة.J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تتبع تجنيد الكريات البيض باستخدام يرقات الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين فلورسنت أخضر قابل للتحويل الضوئي. يتيح الحقن المسبق للبكتيريا ذات الصبغة الفلورية الحمراء في الحويصلة الأذنية والحث على التحويل الضوئي مراقبة هجرة الكريات البيض والبلعمة والتشتت في جميع أنحاء الجسم ، مما يوفر رؤى قيمة حول ديناميكيات الاستجابة المناعية.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير إبر الحقن المجهري

1. قم بإعداد إبر حقن شعرية زجاجية رقيقة الجدار (1.0 OD / 0.75 ID) باستخدام جهاز مجتذب ماصة دقيقة بالإعدادات التالية: ضغط الهواء 200 ، الحرارة 502 ، السحب 90 ، السرعة 80 ، الوقت 70 ، وقت الهواء في بداية السحب 5 ، وقت الهواء في نهاية السحب 5.
2. باستخدام ملاقط دقيقة ، قم بقطع طرف الإبرة المسحوبة بحيث يبلغ قطر فتحة الطرف حوالي 10 ميكرومتر.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تحضير أطباق حقن اليرقات

1. اشطف مشط الجل بعرض حارة حوالي 4-5 مم في ماء معقم واتركه حتى يجف.
2. قم بإعداد محلول الاغاروز عالي الذوبان بنسبة 1.5-2٪ في وسط E3 والميكروويف حتى يصبح المحلول صافيا. بمجرد أن يبرد ، اسكب بعضا من الاغاروز في طبق بتري (100 × 15 مم) ولفه ، مع إضافة ما يكفي من الاغاروز لتغطية قاع الطبق بالكامل.
3. بمجرد أن تصلب طبقة الاغاروز ، ضع مشط الجل المغسول والمجفف في الأعلى بحيث يستقر الطرف غير الممشط على الجزء العلوي من طبق بتري ويلامس الطرف الممشط الاغاروز. تأكد من أن المشط أفقي قدر الإمكان ، مما يخلق زاوية 30 درجة فيما يتعلق بطبقة الاغاروز السفلية.
4. صب كمية صغيرة إضافية من الاغاروز على الواجهة بين المشط وطبقة الاغاروز السفلية بحيث تغطي طبقة الاغاروز الطازجة آبار المشط. اتركيه ليبرد تماما قبل إزالة المشط. باستخدام طرف الماصة ، قم بإزالة أي قطع متدلية من الاغاروز من الآبار.
5. يسكب وسط E3 فوق قالب الحقن ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
6. قبل كل استخدام، استبدلها بمنحدرات حقن متوسطة ودافئة جديدة عند 28.5 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل الحقن.
7. قبل الحقن مباشرة، استبدل E3 على منحدر الحقن بوسط E3 يحتوي على 200 ميكروغرام/مل إيثيل 3-أمينوبنزوات (تريكائين).

< p class = "jove_title" >3. تحضير العقدية iniae (S. iniae) لقاح

1. تحضير والأوتوكلاف وسط مرق تود هيويت مكمل بمستخلص الخميرة 0.2٪ وببتون البروتيوز 2٪ (THY + P): 30 جم / لتر تود هيويت ، 2 جم / لتر مستخلص الخميرة ، 20 جم / لتر بيبتون بروتيوز. بالنسبة لأطباق الأجار ، أضف 14 جم / لتر أجار.
2. قم بإعداد المزارع البكتيرية في الليلة السابقة للعدوى عن طريق سحب 100 ميكرولتر من مخزون البكتيريا المجمد في 10 مل من مرق THY + P في أنبوب مغلق سعة 15 مل. احتضان طوال الليل دون تحريض عند 37 درجة مئوية. بعد 14-16 ساعة من النمو ، استخدم المزرعة الليلية إما لصنع مخزون المجمد أو الاستعداد للاستخدام في الحقن.
3. اصنع مخزون الفريزر عن طريق وضع 1 مل من المزرعة الليلية في 500 ميكرولتر من 80٪ جلسرين في أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 مل. لتجنب دورات التجميد والذوبان ، اصنع 100 ميكرولتر من هذا المزيج وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
4. بالنسبة إلى S. iniae المستخدمة في العدوى ، قم بتخفيف المزرعة الليلية 1: 100 للحصول على حجم إجمالي يبلغ 10 مل عن طريق إضافة 0.1 مل من المزرعة الليلية إلى 9.9 مل من مرق THY + P. تنمو عند 37 درجة مئوية دون تحريض لمدة 4-5 ساعات تقريبا. راقب الكثافة الضوئية (OD) عند 600 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي Nanodrop وحصاد البكتيريا في مرحلة متوسطة لوغاريتمية عندما يصل OD600 نانومتر إلى 0.250-0.500. يتوافق OD600 نانومتر البالغ 0.250 مع ما يقرب من 10⁸ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل.
5. بيليه 1 مل من المزرعة البكتيرية في أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 مل عند 1,500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بقياس OD600 نانومتر من البكتيريا في PBS ، والحبيبات ، وإعادة التعليق في PBS لتحقيق التركيز المطلوب.
6. للمساعدة في تصور الحقن المجهري ، أضف الفينول الأحمر إلى المعلقات البكتيرية قبل الحقن للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.1٪.
7. بالنسبة للتجارب التي تنطوي على حقن البكتيريا المقتولة بالحرارة ، قم بتسخين البكتيريا في PBS عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تأكد من أن عملية قتل الحرارة قللت من عدد البكتيريا القابلة للحياة إلى مستويات لا يمكن اكتشافها عن طريق طلاء حجم الحقن (حوالي 1 nl) على ألواح أجار THY + P الصلبة واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >4. وضع العلامات على S. iniae باستخدام صبغة الفلورسنت الحمراء CellTracker

1. لتسمية الخلايا البكتيرية الحية ، قم بإعداد محلول مخزون من صبغة الفلورسنت CellTracker أو ما يعادلها. نظرا لأن الصبغة المستخدمة تأتي في 20 × 50 ميكروغرام من المسحوق وتحتاج إلى إعادة تعليقها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، أضف 7.3 ميكرولتر DMSO إلى الأنبوب للحصول على تركيز مخزون 10 ملليمتر.
2. اختبر مجموعة من تركيزات الصبغة (على سبيل المثال ، 0.5-25 ميكرومتر) على البكتيريا لتحديد أدنى تركيز مثالي يلطخ الخلايا. قد تتطلب الخلايا سريعة الانقسام والتجارب الأطول تركيزا أعلى من الصبغة.
   1. بيليه 1.0 مل من المزرعة البكتيرية في أنبوب 1.7 مل بالطرد المركزي كما هو موضح أعلاه (القسم 3). أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS الطازج وأضف الحجم المناسب من الصبغة إلى الثقافة البكتيرية.
   2. احتضن بدون تحريض عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتدوير البكتيريا وإعادة تعليقها في 1 مل من مرق THY + P المسخن مسبقا واحتضنه دون تحريض لمدة 30 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية.
   3. قم بتدوير البكتيريا وغسلها مرتين في PBS قبل قياس OD600 نانومتر وتخفيف البكتيريا للحقن المجهري كما هو مفصل أعلاه (القسم 3). عادة ما نقوم بحقن ما يقرب من 100 CFU في حجم حقن 1 nl لدراساتنا عن تجنيد الكريات البيض والبلعمة.

< p class = "jove_title" >5. تحضير يرقات الزرد للعدوى

1. قم بإعداد أزواج التكاثر في الليلة السابقة وجمع الأجنة كما وصفها روزين وآخرون.احتضان الأجنة في وسط E3 عند 28.5 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للإصابة.
2. بالنسبة لأسماك الزرد التي سيتم تصويرها ، امنع تطور الصباغ (الميلانيز) عن طريق إضافة N-Phenylthiourea (PTU) إلى وسط E3 بعد 24 ساعة من الإخصاب (HPF) للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.2 نانومتر.
3. بالنسبة للعدوى التي تنطوي على أجنة تتراوح أعمارها بين يومين بعد الإخصاب (dpf) ، قم بإزالة الأجنة يدويا باستخدام زوج من الملقط الناعم. بدلا من ذلك ، قم بإزالة الأجنة عن طريق إزالة E3 واستبدالها ببروناز (2 مجم / مل) لمدة 5 دقائق تقريبا أو حتى تؤدي الماصة اللطيفة إلى إخراج الأجنة من المشيمة. يجب أن تفقس معظم اليرقات بشكل طبيعي بمقدار 3 dpf.
4. قم بتخدير سمك الزرد قبل عدة دقائق من الإصابة عن طريق وضع يرقات مكسرة في وسط E3 يحتوي على 200 ميكروغرام / مل من التريكيين.

< p class = "jove_title" >6. حقن الحويصلة الأذنية ل S. iniae في يرقات عمرها ثلاثة أيام

1. قم بتشغيل الحاقن الدقيق واضبط النطاق الزمني على "مللي ثانية". افتح الصمام الموجود على خزان ثاني أكسيد الكربون للسماح للغاز بالدخول إلى الخط. يجب أن يقرأ ضغط الحاقن الدقيق حوالي 20 رطلا لكل بوصة مربعة (PSI). اضبط الضغط في وحدة الحاقن الدقيق عن طريق تدوير المقبض المخرش الأسود في اتجاه عقارب الساعة لزيادة الضغط أو الدوران عكس اتجاه عقارب الساعة لتقليل الضغط.
2. دوامة S. iniae المحضرة باللون الأحمر الفينول و PBS واستخدم طرف اللودر الدقيق لتحميل 2-3 ميكرولتر من المزرعة في إبرة حقن شعرية مسحوبة.
3. قم بتركيب الإبرة المحملة على مناور دقيق متصل بحامل مغناطيسي وضعه تحت مجهر مجسم بحيث تكون الإبرة بزاوية 45-65 درجة تقريبا فيما يتعلق بقاعدة المجهر.
4. اضغط على دواسة قدم الحاقن الدقيق لتوزيع قطرة من اللقاح على طرف الإبرة. قم بقياس قطر القطرة باستخدام شريط المقياس في عدسة العين بالمجهر.
   1. بدلا من ذلك ، قم بتقدير قطر القطرة عن طريق حقن حجم في قطرة من الزيت المعدني على شريحة مجهر زجاجي بقضيب مقياس. يجب أن يكون قطر القطرة حوالي 0.10 مم ، أي حوالي 1 nl.
   2. اضبط حجم القطرة عن طريق ضبط إعداد المدة على الحاقن الدقيق أو عن طريق قص المزيد من طرف الإبرة باستخدام ملاقط دقيقة. لاحظ أن وقت الحقن يجب أن يتراوح بين 20 - 35 مللي ثانية لتجنب التسبب في الكثير من تلف الأنسجة.
5. باستخدام ماصة نقل البلاستيك ، انقل 12 يرقة مخدرة إلى كل بئر من قالب الحقن.
6. استخدم قضيبا زجاجيا أو حلقة شعر أو طرفا بلاستيكيا لوضع اليرقات برفق بحيث يتم توجيه الرؤوس نحو الجزء الخلفي من المجهر وتكون أكياس الصفار على الجانب الأيسر من البئر. وجه الأذن اليسرى لليرقة نحو السقف.
7. بالنظر من خلال عدسة العين للمجهر المجسم ، استخدم المقابض الموجودة على المعالج الدقيق لمحاذاة الإبرة المحملة مع الحويصلة الأذنية بحيث يكون كلاهما في نفس مجال الرؤية. اثقب الطبقة الظهارية الخارجية للحويصلة الأذنية بطرف الإبرة بحيث يكون طرف الإبرة داخل الحويصلة مباشرة.
8. اضغط على دواسة القدم لحقن 1 nl من الجرعة المطلوبة من S. iniae. تأكد من استخدام ضغط منخفض بما يكفي حتى لا تمزق التجويف. إذا نجح الحقن ، يجب أن تمتلئ الحويصلة الأذنية ، ولكن ليس الأنسجة المحيطة ، باللقاح الأحمر الفينول (الشكل 1 Ai). قم بإزالة أي أسماك تم حقنها بشكل خاطئ على الفور من لوحة الحقن.
9. اسحب الإبرة بعناية من اليرقة وحرك لوحة الحقن يدويا بحيث تظهر اليرقة التالية. افعل ذلك تحت تكبير 5X.
   ملاحظه: قد يؤدي تراجع الإبرة إلى ترسب بعض البكتيريا خارج الحويصلة الأذنية ، مما قد يؤدي إلى انحراف نتائج البقاء على قيد الحياة وتجنيد الكريات البيض. لتجنب ذلك ، يوصى بحقن البكتيريا ذات العلامات الفلورية والمسح الضوئي البصري لليرقات المحقونة تحت المجهر الفلوري لإزالة أي يرقات يحدث فيها ذلك. تظهر اليرقة المحقونة بشكل صحيح في (الشكل 1 Bi).
10. لضمان بقاء حجم الحقن / اللقاح كما هو على مدار التجربة ، قم بحقن قطرة من المعلق البكتيري في أنبوب طرد مركزي سعة 1.7 مل يحتوي على 100 ميكرولتر من PBS المعقم بعد كل 48 جنين. قم بلوحة 100 ميكرولتر على ألواح أجار THY + P عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتحديد CFU في حجم الحقن.
11. عندما يتم حقن المجموعة الكاملة المكونة من 12 يرقة على منحدر الحقن ، استخدم بعناية ماصة نقل بلاستيكية لإزالة اليرقات من الآبار ووضعها في طبق بتري جديد (35 × 10 مم²). قم بإزالة محلول التريكيين واستبدله بحوالي 2 مل من وسط E3 الطازج للسماح لليرقات بالتعافي.
12. قام Pipet بحقن اليرقات في آبار مفردة من صفيحة مكونة من 96 بئرا وتحضنها عند 28.5 درجة مئوية. راقب اليرقات بمرور الوقت للبقاء على قيد الحياة في هذه الألواح أو قم بإزالتها لاحقا للتصوير أو حساب CFU.

7. تثبيت اليرقات للتصوير

1. قم بتثبيت اليرقات في محلول بارافورمالدهيد مثلج بنسبة 4٪ في محلول PBS كما هو موضح في القسم 7.
2. في درجة حرارة الغرفة ، اغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في PBS قبل التصوير.

< p class = "jove_title" >8. تحضير اليرقات للتصوير الحي

1. قم بإعداد محلول الاغاروز منخفض نقطة الانصهار بنسبة 1.5٪ في E3 عن طريق تسخينه في الميكروويف حتى يصبح المحلول صافيا.
2. ضع محلول الاغاروز في حمام مائي 55 درجة مئوية للسماح له بالتبريد ولكن لا يتماسك.
3. أضف التريكيين إلى الاغاروز إلى التركيز النهائي بنسبة 0.016٪.
4. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، ضع 4-5 يرقات مخدر في طبق زجاجي القاع على مسرح المجهر المجسم.
5. قم بإزالة محلول التريكيين والأغاروز من الحمام المائي 55 درجة مئوية واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة. أثناء تبريد الاغاروز ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من اليرقات المخدرة.
6. يسكب الاغاروز المبرد في الطبق حتى يتم تغطية حوالي نصف السطح. حرك الطبق لنشر الاغاروز. لاحظ أنه إذا كان الاغاروز ساخنا جدا ، فسوف يقتل اليرقات. أيضا ، إذا تمت إضافة الكثير من agarose إلى الطبق ، فقد تصطدم العدسة الموضوعية للمجهر بقاع الطبق عند التركيز من خلال الاغاروز.
7. باستخدام ماصة النقل ، التقط اليرقات التي تطفو على جوانب الطبق وأعدها إلى المنتصف.
8. تحت المجهر المجسم، ضع اليرقات برفق حسب الرغبة باستخدام حلقة شعر أو طرف ماصة طويل أو قضيب زجاجي. لتصوير الحويصلة الأذنية ، ضع اليرقات بحيث تكون الحويصلة الأذنية اليسرى مسطحة على قاع الطبق.
9. دع الاغاروز يبرد لمدة 10 دقائق قبل تحريك الطبق. قد تغير اليرقات مواقعها إذا لم يكن الاغاروز صلبا. ضع بعض محلول التريكائين و E3 برفق في الجزء العلوي من طبقة الاغاروز للحفاظ على رطوبتها.

< p class = "jove_title" >9. التصوير متحد البؤر للعدوى

1. ضع الطبق السفلي الزجاجي مع اليرقات على مسرح المجهر المقلوب باستخدام نظام متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر FV-1000.
2. اضبط الثقب على 200-300 ميكرومتر وباستخدام عدسة موضوعية بفتحة رقمية 0.75 / 20X ، قم بتعيين مجموعات z بشرائح 3-6 ميكرومتر.
3. استخدم المسح الضوئي المستمر للخط لضبط طاقة الليزر وكسب الكاشف لكل قناة.
4. باستخدام مسح الخط المتسلسل لكل قناة مضان (على سبيل المثال ، 488 و 543 نانومتر) وتباين التداخل التفاضلي (DIC) ، قم بإجراء فيلم بفاصل زمني للحويصلة الأذنية اليسرى كل 3 دقائق لمدة 2-6 ساعات لمراقبة التجنيد الأولي والبلعمة بواسطة العدلات والضامة. للحصول على دورات زمنية أطول ، ضع غطاءا على طبق بتري لمنع التبخر والجفاف من الاغاروز.
5. احصل على صور ثابتة لليرقات الثابتة (الشكل 1 ب) أو الحية (الشكل 2) بتكبير 20X أو 40X.

فئة

10. التحويل الضوئي للكريات البيض المسماة Dendra2 في حويصلة الأذن

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يمكن تحويل Dendra2 من التألق الأخضر إلى الأحمر عن طريق تركيز ليزر 405 نانومتر (يجب أن تكون طاقة الليزر 50-70٪ كافية) على منطقة الاهتمام (ROI) لمدة 1 دقيقة. يوجد أدناه البروتوكول خطوة بخطوة المستخدم لنظام متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر FV-1000:

1. تصور العينة باستخدام مسح z-stack باستخدام ليزر 488 نانومتر و 543 نانومتر. استخدم مسح الخط المستمر لضبط طاقة الليزر وكسب الكاشف. تحقق للتأكد من عدم وجود مضان أحمر محول ضوئيا عن طريق الخطأ.
2. في نافذة "التحكم في الحصول على الصور" ، ضمن "إعداد التحفيز" ، حدد أداة "استخدام الماسح الضوئي" واختر "رئيسي". حدد ليزر 405 نانومتر واضبطه على طاقة 70٪. باستخدام خيار الدائرة ، حدد عائد الاستثمار في الحويصلة الأذنية.
3. ضمن "إعداد بدء التحفيز" ، حدد "التنشيط في سلسلة" مع تنشيط مسبق لإطار واحد ووقت تنشيط يبلغ 60,000 مللي ثانية. في نافذة "إعداد الاكتساب" ضمن عنوان "مسح الوقت"، اختر فترتين من 00:01:00 (واحدة لما قبل التحويل الضوئي والأخرى لما بعد تحويل الصور).
   ملاحظه: بعد اكتمال فحص سلسلة الفاصل الزمني ، يجب تحويل Dendra2 إلى حالة الفلورسنت الحمراء.
4. امسح العينة ضوئيا بواسطة مكدس z باستخدام ليزر 488 نانومتر و 543 نانومتر لتصور التألق الأحمر المحول ضوئيا بالإضافة إلى أي مضان أخضر متبقي (الشكل 3).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تجنيد الكريات البيض لعدوى حويصلة الأذن ب S. iniae. (أ) تجنيد العدلات لعدوى S. iniae. (ط) الحقن الناجح لللقاح ذو العلامات الحمراء بالفينول في الحويصلة الأذنية. (ثانيا - رابعا) السودان تلطيخ أسود لليرقات للتحقيق في تجنيد العدلات عند 2 hpi. تظهر اليرقات المصابة بجهاز تلفزيون PBS القليل من تجنيد العد...

المواد