تصوير الطور الكمي ثلاثي الأبعاد لتوصيف الأنواع الفرعية للخلايا الليمفاوية

الملخص

المصدر: Yoon، J. et al. تحديد خالية من الملصقات للأنواع الفرعية للخلايا الليمفاوية باستخدام التصوير الكمي ثلاثي الأبعاد والتعلم الآلي. J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو التحديد الخالي من الملصقات لمورفولوجيا الخلايا الليمفاوية والكيمياء الحيوية من خلال تصوير الطور الكمي ثلاثي الأبعاد. تسمح هذه التقنية بإجراء تحليل شامل للخلايا الليمفاوية ، والكشف عن هياكلها الداخلية وخصائصها دون الحاجة إلى إجراءات وضع العلامات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. قياس التدفق الخلوي وفرز الأنواع الفرعية للخلايا الليمفاوية

ملاحظة: يعد فرز الخلايا الليمفاوية اعتمادا على نوع الخلية أمرا ضروريا لإنشاء تسميات نوع الخلية الحقيقية (أي الصحيحة) لتدريب واختبار مصنف نوع الخلية في التعلم الخاضع للإشراف. يستخدم قياس التدفق الخلوي ، وهي طريقة قياسية ذهبية ، لتحديد الخلايا الليمفاوية وفصلها.

1. اصنع مزيجا من الأجسام المضادة لتلوين علامات السطح في 100 ميكرولتر من وسط RPMI-1640 الطازج [مع 10٪ FBS ، 0.1 ميكروغرام من CD3e (17A2) ، CD8a (53-6.7) ، CD19 (1D3) ، CD45R (B220 ، RA3-6B2) ، و NK1.1 (PK136)] و 0.25 ميكروغرام من الأجسام المضادة CD4 (GK1.5) لاستهداف الخلايا الليمفاوية B و CD4 ⁺ T و CD8 ⁺ T.
2. أضف 100 ميكرولتر من خليط الجسم المضاد إلى معلق الخلية.
3. احتضن لمدة 25 دقيقة على الثلج.
4. اغسل الخلايا بإضافة 5 مل من PBS والطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، مرتين.
5. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط RPMI-1640 الطازج مع 10٪ FBS و 2.5 ميكروغرام من DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole).
6. اجمع كل نوع من أنواع الخلايا الليمفاوية على حدة باستخدام قياس التدفق الخلوي باستخدام مستويات التألق للعلامات الموضحة أعلاه. استبعاد الخلايا الميتة في نفس الوقت باستخدام إشارات DAPI.

2. 3D تصوير المرحلة الكمية

1. احتفظ بالخلايا الليمفاوية التي تم فرزها على الجليد طوال إجراءات التصوير ، والتي يجب أن تكتمل في غضون 5 ساعات (منذ عزل الخلايا الليمفاوية عن الفأر) لتجنب تلف الخلايا والتغيرات الكيميائية الحيوية.
2. حدد نوع الخلايا المرتبة (من بين الخلايا الليمفاوية B و CD4 ⁺ T و CD8 ⁺ T) وقم بتخفيف العينة إلى 180 خلية / ميكرولتر مع وسيط RPMI للحصول على ظروف التصوير المثلى (أي خلية واحدة لكل مجال رؤية واحد).
3. قم بتحميل 120 ميكرولتر من العينة المخففة في غرفة التصوير عن طريق الحقن البطيء. تحقق بدقة من وجود الفقاعات في غرفة التصوير مع العينة. إذا كانت هناك فقاعات ، فقم بإزالتها بعناية ، لأنها ستضر بجودة القياسات.
4. الحصول على التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد RI باستخدام مجهر الطور الكمي ثلاثي الأبعاد التجاري ، أو التصوير المجسم ، وبرنامج التصوير الخاص به.
   ملاحظة: يمكن العثور على معلومات مفصلة حول الإعداد التجريبي في المخطوطة الأصلية.
   1. ضع قطرة من الماء المقطر فوق العدسة الشيئية للمجهر.
   2. ضع غرفة التصوير مع العينة في مرحلة ترجمة المجهر واضبط موقعها بحيث تتماشى العينة مع العدسة الموضوعية.
   3. اضبط المواضع المحورية للعدسات الموضوعية والمكثفة بالنقر فوق التركيز والسطح ، على التوالي ، في علامة التبويب "معايرة" في منظور "المجهر" لبرنامج التصوير.
   4. قم بمحاذاة عدسات الهدف والمكثف بالنقر فوق الوضع التلقائي. بدلا من ذلك، استخدم وضع المسح الضوئي واضبط العدسات يدويا بحيث يتم تحديد أنماط الإضاءة في المنطقة المركزية من مجال الرؤية.
   5. ارجع إلى الوضع العادي واضبط مرحلة الترجمة لتحديد موقع خلية في مجال العرض.
   6. أوجد المستوى البؤري عن طريق ضبط الموضع المحوري للعدسة الشيئية. التركيز البؤري المثالي يجعل حدود العينة المرئية على الشاشة غير مرئية تقريبا.
   7. اضبط مرحلة الترجمة للعثور على موقع بدون خلية.
   8. انقر فوق معايرة لقياس الصور المجسمة ثنائية الأبعاد متعددة بزوايا إضاءة مختلفة.
   9. اضبط مرحلة الترجمة لتحديد موقع خلية في وسط مجال الرؤية.
   10. انتقل إلى علامة التبويب "اكتساب" وانقر فوق 3D Snapshot لقياس الصور المجسمة للخلية بزوايا إضاءة متطابقة كما هو الحال في الخطوة 2.4.8.
   11. عند عرض البيانات المكتسبة في لوحة "إدارة البيانات" ، انقر بزر الماوس الأيمن على البيانات المكتسبة وانقر فوق عملية لإعادة بناء التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد من الصور المجسمة المقاسة في الخطوتين 2.4.8 و 2.4.10 ، باستخدام خوارزمية التصوير المقطعي للحيود المطبقة في برنامج التصوير.
   12. كرر الخطوات 2.4.5-2.4.11 لقياس أكثر من 100 خلية لضمان القوة الإحصائية للتعلم الآلي.
   13. يمكن تصور جميع الصور التي تتم معالجتها من خلال الخطوة 2.4.11. في لوحة "إدارة البيانات"، انقر بزر الماوس الأيمن فوق البيانات وانقر فوق فتح لعرض البيانات. انقر فوق RI Tomogram في لوحة "Data Manager". في علامة التبويب "الإعداد المسبق"، انقر فوق تحميل وانقر نقرا مزدوجا فوق "lymphocyte.xml"، وهي وظيفة نقل محددة مسبقا يوفرها برنامج التصوير لتصور التصوير المقطعي وفقا لتوزيعات 3D RI.
5. كرر الخطوات 2.2-2.4 لقياس التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد RI لجميع الأنواع الفرعية للخلايا الليمفاوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قياس التدفق الخلوي BD Biosciences أريا الثاني أو الثالث غرفة التصوير شركة توموكوب توموديش التصوير المجسم توموكوب ، إنك HT-1H برنامج التصوير المجسم شركة توموكوب تومو ستوديو برامج معالجة الصور الرياضيات Matlab R2017b أنبوب الطرد المركزي المخروطي Falcon ثيرموفيشر العلمي 14-959-53 أ 15 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيجما ألدريتش 806544-500 مل عازلة تحلل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم ثيرموفيشر العلمي A1049201 RPMI-1640 متوسط سيجما ألدريتش R8758 مصل الأبقار الجنينية ثيرموفيشر العلمي 10438018