تقنية لاستخراج الحمض النووي بوساطة الجسيمات الزجاجية المغناطيسية من الدم

الملخص

المصدر: Rosenstierne ، M. W. ، et al. استخراج الحمض النووي اليدوي السريع والآمن والبسيط بجانب السرير للكشف عن الفيروس في عينات الدم الكاملة. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لاستخراج الحمض النووي من دم الإنسان الكامل باستخدام جزيئات الزجاج المغناطيسي (MGPs) - حبات مغناطيسية صغيرة مطلية بالسيليكا. عند تحلل خلايا الدم باستخدام محلول تحلل ، ترتبط الأحماض النووية المنبعثة بسطح MGPs المطلية بالسيليكا ، وتستخرج الجزيئات من العينة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد

< p class = "jove_title" >1. جمع الدم من المرضى

تنبيه: اتخذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة عند جمع الدم الكامل من المريض. ارتد القفازات والنظارات. إذا كان المريض في عزلة ، فيرجى اتباع إجراءات السلامة البيولوجية من المستوى 4.

1. لجمع الدم الكامل عن طريق الوريد من المريض ، استخدم إبرة فراشة مع أنبوب تمديد صغير التجويف وأنبوب مفرغ لجمع الدم يحتوي على محلول تحلل / ربط. ضع ذراع المريض في وضع لأسفل وضع أنبوب التجميع أقل من إبرة الفراشة. أدخل إبرة الفراشة في وريد المريض وقم بتوصيل الأنبوب المفرغ لجمع الدم بالامتداد الصغير.
   ملاحظه: هذا سيمنع التدفق العكسي.
2. بعد جمع الدم ، امزج محتويات الأنبوب عن طريق قلب الأنبوب 5 - 10 مرات.
   ملاحظه: نظرا للفراغ المتبقي في أنبوب جمع الدم الذي يحتوي على 1.6 مل من محلول التحلل / الربط ، فإن حجم العينة التي تم جمعها سيكون تلقائيا 1.6 مل.
3. تطهير الجزء الخارجي من الأنبوب باستخدام 70٪ إيثانول.
4. احتضان الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ويمكن تخزين أنابيب جمع الدم الكاملة عند -20 درجة مئوية أو 5 درجات مئوية أو 25 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
5. تابع مباشرة إلى طريقة استخراج NA المبسطة.

< p class = "jove_title" >2. استخراج NA المبسط للدم الكامل

1. لتنقية NA من الدم الذي تم جمعه بالتحلل / الربط المعطل بالمخزن المؤقت ، امزج محتويات الأنبوب عن طريق قلب الأنبوب المفرغ يدويا 5-10x.
2. قم بإزالة غطاء الأنبوب بعناية وقم بتفريغ الغطاء.
3. صب الكمية المحضرة من MGPs (1 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
4. ضع غطاءا جديدا من أنبوب جمع الدم غير المستخدم على الأنبوب الذي يحتوي على العينة.
5. ضع إصبعا على الغطاء للتأكد من إغلاق الأنبوب بإحكام واخلط محتويات الأنبوب عن طريق قلب أنبوب جمع الدم يدويا 5-10 مرات.
6. ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي واحتفظ بإصبعك على الغطاء للتأكد من إغلاق الأنبوب بإحكام.
7. اقلب الحامل المغناطيسي بالأنبوب عدة مرات يدويا للتأكد من جمع جميع MGPs على جانب الأنبوب باستخدام المغناطيس.
   ملاحظه: يمكن استبدال الحامل المغناطيسي بمغناطيس ممدود وشريط مطاطي.
8. قم بإزالة غطاء الأنبوب وتخلص من محتويات الأنبوب إما باستخدام ماصة يمكن التخلص منها أو ببساطة عن طريق صب المحتويات في أنبوب تجميع سعة 50 مل.
   ملاحظه: تجنب الهباء الجوي من أنبوب التجميع سعة 50 مل عن طريق إغلاق الأنبوب بغطاء.
9. صب الكمية المحضرة من محلول الغسيل -1 (WB-1 ، 4 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
10. ضع الغطاء على الأنبوب وضع إصبعا على الغطاء للتأكد من إغلاق الأنبوب بإحكام.
11. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي ، مع إبقاء الغطاء مشدودا بإحكام بإصبع.
    ملاحظه: إذا كنت تستخدم مغناطيسا وشريطا مطاطيا ، فما عليك سوى إزالة الشريط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
12. أعد تعليق MGPs عن طريق قلب أنبوب جمع الدم يدويا من 5 إلى 10 مرات.
13. كرر الخطوات 2.6 - 2.8.
14. صب الكمية المحضرة من WB-2 (1.5 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
15. ضع الغطاء على الأنبوب وقم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي.
    ملاحظه: إذا كنت تستخدم مغناطيسا وشريطا مطاطيا ، فما عليك سوى إزالة الشريط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
16. ضع إصبعا على الغطاء للتأكد من إغلاق الأنبوب بإحكام.
17. أعد تعليق MGPs عن طريق قلب أنبوب جمع الدم لبضع ثوان يدويا.
18. كرر الخطوات 2.6 - 2.8.
19. صب الكمية المحضرة من WB-3 (3 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
20. ضع الغطاء على الأنبوب وقم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي.
    ملاحظه: إذا كنت تستخدم مغناطيسا وشريطا مطاطيا ، فما عليك سوى إزالة الشريط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
21. ضع إصبعا على الغطاء للتأكد من إغلاق الأنبوب بإحكام.
22. أعد تعليق MGPs عن طريق قلب أنبوب جمع الدم يدويا من 5 إلى 10 مرات.
23. كرر الخطوات 2.6 - 2.8.
24. صب الكمية المحضرة من محلول الشطف (EB ، 100 ميكرولتر) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
25. ضع الغطاء على الأنبوب وقم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي.
    ملاحظه: إذا كنت تستخدم مغناطيسا وشريطا مطاطيا ، فما عليك سوى إزالة الشريط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
26. أعد تعليق MGPs في EB عن طريق النقر على أنبوب جمع الدم 5-10 مرات بإصبع.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، ويمكن تخزين الأنابيب عند -20 درجة مئوية.
27. انقل قطرة واحدة (5 - 8 ميكرولتر) من MGPs المعلقة إلى مزيج تفاعل تضخيم NA المصب باستخدام ماصة يمكن التخلص منها 1.5 مل (أي مقايسة تضخيم NA تشخيصية في المصب مثل التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) / النسخ العكسي LAMP (RT-LAMP) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) / RT-qPCR يمكن استخدامها).
    ملاحظه: ستلتزم NAs ب MGPs ، لذا تأكد من استخدام MGPs في تفاعل تضخيم NA في اتجاه مجرى النهر. امزج معلق MGP قبل الاستخدام. بعد الخلط ، سوف تتجمع MGPs في قاع الأنبوب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنابيب Vacutainer K2 EDTA (4 مل) بيكتون ديكنسون 368861 بالإضافة إلى جمع الدم بيكتون ديكنسون 362725 23 جم × 1 إبرة بيكتون ديكنسون 300800 حقنة LUER LOK (3 مل) بيكتون ديكنسون 309658 إبرة فراشة مع أنابيب تمديد صغيرة التجويف يورغن كروس أ / س 121714 1٪ فيركون نوميكو أ / إس 849265 مجموعة عزل الحمض النووي MagNA Pure LC I - عازلة التحلل / الربط - إعادة التعبئة تشخيص روش A / S 3246752001 مجموعة عزل الحمض النووي الكلي MagNA Pure LC تشخيص روش A / S 3038505001 Nunc™ Biobanking وأنابيب مبردة لثقافة الخلايا (1,8 مل) ثيرمو فيشر العلمي 375418 Nunc™ Biobanking وأنابيب مبردة لثقافة الخلايا (3,6 مل) ثيرمو فيشر العلمي 379189 Nunc™ Biobanking وأنابيب مبردة لزراعة الخلايا (4,5 مل) ثيرمو فيشر العلمي 379146 مغناطيس DynaMag-5™ ثيرمو فيشر العلمي 12303 د ماصة النقل (3.5 مل) سارستيدت 86.1171.010 ماصات سامكو™ ذات الطرف الدقيق من Thermo Scientific™ (1.5 مل) ثيرمو فيشر العلمي 231 Thermo Scientific™ Nunc™ 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادة البولي بروبيلين ثيرمو فيشر العلمي 339652