تصوير فائق الدقة لتكوين المشبك المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية على طبقة ثنائية دهنية مدعومة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Zheng ، P. ، et al. تصوير فائق الدقة للمشبك المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية على طبقة ثنائية دهنية مستوية مدعومة بالزجاج. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتصور تكوين المشبك المناعي في الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) على طبقة ثنائية الدهون المدعومة (SLB). تم تصنيف SLB لأول مرة بخلية NK تحمل علامة الفلوروفور تنشط ترابط المستقبلات ، تليها حضانة بخلايا NK. بعد ذلك ، يتم تلطيخ الخلايا من أجل الأكتين المبلمر وحبيبات الليتيك الإيجابية للبيرفورين. يتيح هذا النهج تصور تكوين المشبك باستخدام الفحص المجهري لنضوب الانبعاث المحفز (STED).

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير الجسيمات الشحمية

1. احسب كمية محاليل المخزون المعلقة بالكلوروفورم من 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) و 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (Biotin-PE) لعمل مخزونات مخففة بالتركيز النهائي المطلوب. لعمل تركيزات نهائية من 400 ميكرومتر DOPC و 80 ميكرومتر من الدهون الفوسفورية البيوتين-PE عند 10 مل لكل منهما ، ابدأ بوضع 629 ميكرولتر من 10 مجم / مل DOPC و 88 ميكرولتر 10 مجم / مل Biotin-PE في أنابيب كروماتوغرافيا زجاجية ><منفصلة. ملاحظة: من المهم تنظيف محاقن هاميلتون الزجاجية وأنابيب الكروماتوغرافيا الزجاجية عن طريق تنظيف المحلول (1 لتر 95٪ إيثانول إلى 120 مل ماء يحتوي على 60 جم من هيدروكسيد البوتاسيوم ، KOH) أثناء نقل محلول المخزون المعلق بالكلوروفورم من DOPC و Biotin-PE.
2. جفف الكلوروفورم بتيار من الأرجون في الغطاء الكيميائي. أغلق أنبوب الكروماتوغرافيا بالبارافيلم
3. قم بتعريض الجسيمات الشحمية المجففة حديثا لفراغ عال في مجفف التجفيد طوال الليل (O / N) لإزالة أي كلوروفورم متبقي. للانتهاء في نفس اليوم ، يجف لمدة 60-90 دقيقة.
4. أثناء تشغيل المجفف بالتجميد ، قم بإعداد بعض المخزن المؤقت للتخفيف. لهذا البروتوكول ، قم بإعداد 25 مل يتكون من 25 ملي تريس ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 150 ملي كلوريد الصوديوم ؛ و 2٪ (بالوزن) منظف n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG). اخلطي المكونين الأولين معا أولا ، ثم أزل الأكسجين بالأرجون قبل إضافة مسحوق OG الجاف. بعد التحضير ، قم بتصفية محلول OG بغشاء أسيتات السليلوز 0.2 ميكرون ، وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
5. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد زجاجتين لولبيتين سعة 1 لتر من محلول ملحي ثلاثي المحلول الملحي بنفس التركيزات ، ولكن بدون OG. ضع قضيب تقليب مغناطيسي مقطر بالماء في قاع كل منها. قم بإعداد 6 لترات إضافية من محلول ملحي Tris. قم بإزالة الأكسجين من جميع الزجاجات التي تحتوي على الأرجون وضعها على حرارة 4 درجات مئوية أيضا.
6. بعد التجميد ، قم بإذابة الدهون المجففة في محلول Tris-saline OG لعمل محلول 4 ملي مولار لكل منها. باتباع أمثلة المجلدات ، أضف 2 مل إلى أنبوب DOPC ، و 0.2 مل إلى أنبوب Biotin-PE.
7. امزج دهون البيوتين PE مع دهون DOPC. هذا يحسن حركة SLB ، حيث يمكن أن يضعف البيوتين المقترن سيولة مجموعات رأس الفوسفات. لعمل تركيز نهائي قدره 80 ميكرومتر من البيوتين PE ، اخلطي 0.2 مل من 4 ملي بيوتين-PE و 1 مل من 4 ملي مولار DOPC. ثم أضف 8.8 مل من المخزن المؤقت Tris-saline OG.
8. للحصول على تركيز نهائي يبلغ 400 ميكرومتر DOPC ، ما عليك سوى خلط 1 مل من 4 ملي مولار DOPC مع 9 مل من Tris-saline OG.
9. املأ الصوتنة بالماء المثلج. ضع الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على الدهون الفوسفورية المخففة في وسط جهاز الصوتنة باستخدام مشبك المرافق. قم بتقطيع الدهون الفوسفورية المخففة لمدة 10 دقائق حتى يصبح المحلول صافيا.
   ملاحظه: أضف الثلج إلى حمام الماء الصوتي للحفاظ على درجة الحرارة منخفضة لأن الصوتنة ستولد الحرارة.
10. املأ الأنابيب بالأرجون لإزاحة الأكسجين في الهواء السائل وإغلاقها بالبارافيلم

< p class = "jove_title" >2. غسيل الكلى للجسيمات الشحمية

1. قم بقص قسمين من أنابيب غسيل الكلى الجافة (قطع الوزن الجزيئي: 12-14,000 ، القطر: 6.4 مم) بطول مناسب (في هذا المثال ، 40 سم) ، واحد لكل تخفيف فوسفوليبيد ، من اللفة.
2. أعد ترطيب أقسام الأنابيب عن طريق السماح لها بالنقع في 200 مل من الماء المقطر في دورق زجاجي لمدة دقيقتين.
3. ضعه في الميكروويف لمدة 5 دقائق على درجة حرارة عالية ، أو على الأقل حتى يغلي الماء.
4. اربط عقدة في أحد طرفي كل أنبوب واشطف الجزء الداخلي ببضعة ملليلترات من عازلة Tris-saline-OG. بعد ذلك ، اضغط بدقة على أكبر قدر ممكن من مخزن الغسيل هذا لتقليل كمية المخزن المؤقت المتبقية بالداخل.
5. في غطاء التدفق الصفحي ، أضف الدهون الفوسفورية المخففة في كل أنبوب وقم بتثبيت الأطراف المفتوحة بإغلاق أنبوب غسيل الكلى الصغير لاستبعاد كل الهواء. سيتطلب استبعاد الهواء الكامل التضحية بحجم صغير من العينة عن طريق التثبيت أسفل "خط الماء".
6. اغمر العينات في الزجاجات المحضرة مسبقا من محلول ملحي Tris-saline بدون OG. قم بإزاحة الأكسجين في الزجاجة بالأرجون قبل إعادة إغلاقها وضعها لتقليب O / N عند 4 درجات مئوية.
7. انقل الأنبوب إلى زجاجة جديدة من محلول ملحي Tris-aloline بدون OG كل 12 ساعة لمدة 3 مرات على الأقل.
8. قبل فترة وجيزة من إزالة الدهون المصابة بالكلى ، قم بإعداد عدد من الأنابيب الصغيرة التي يتم فيها نقل الدهون عن طريق ملء كل منها بالأرجون لإزاحة الأكسجين.
9. بعد 36 ساعة ، خذ زجاجات غسيل الكلى إلى غطاء التدفق الصفحي وقم بإزالة أنابيب غسيل الكلى من الزجاجات. احصل على حفاضات أو دورق في متناول اليد لجمع الجريان السطحي الرطب.
10. قم بقص أنبوب غسيل الكلى فوق المشبك ، ثم قم بإزالة المشبك وانقل محلول الدهون المحلل بعناية عبر الماصة إلى 1 مل في أنابيب معدة مسبقا مملوءة بغاز الأرجون على الثلج.
قم
11. بنقل محلول الجسيمات الشحمية المائية ، واستخدم تيار الأرجون لإزاحة الأكسجين مرة أخرى في كل أنبوب.
12. قم بتخزين الجسيمات الشحمية عند 4 درجات مئوية. لا تجمد.

< p class = "jove_title" >3. عزل واستزراع الخلايا الطبيعية البشرية

1. Aliquot 15 مل من الدم المحيطي أو معطف مصفري في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. تمييع هذا الدم بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) بنسبة 1: 1.
2. أضف 13 مل من Ficoll برفق إلى قاع الأنبوب باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل.
3. جهاز الطرد المركزي هذا الأنبوب لمدة 20 دقيقة عند 1,200 × جم مع المسرع والكسر أو في أدنى إعداداته.
4. بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة مصلية لجمع الطبقة الوسطى البيضاء العائمة من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) ، والتي يجب أن تجلس والتقاطع بين الطبقة العليا الصفراء الصافية والطبقة السفلية ذات اللون الباهت الأكثر غائما ، وكلاهما يقع فوق طبقة سفلية من خلايا الدم الحمراء (RBCs). ملاحظة: لا تجمع أي كرات الدم الحمراء في تحصيل PBMCs.
5. ضع PBMCs المجمعة في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل ، وقم بتخفيفه إلى السعة باستخدام PBS الذي يحتوي على 1٪ FBS. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، هذه المرة مع وجود الفرامل والموقود كحد أقصى ، لمدة 5 دقائق عند 300 × جم.
6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من PBS التي تحتوي على 1٪ FBS.
7. عد الخلايا أثناء الطرد المركزي مرة أخرى في نفس الإعدادات كما في الخطوة 3.6.
8. تخلص من المادة الطافية مرة أخرى ، وأعد تعليق الخلايا في وسط R10 بكثافة 10 ملايين خلية / مل.
9. خذ 30 مليون خلية في أنبوب البوليسترين سعة 5 مل ، وعزل الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام مجموعة فصل مغناطيسية ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد العزل ، عد الخلايا مرة أخرى وأعد تعليقها بكثافة 500,000 خلية / مل في وسط R10 الكامل (88٪ وسط معهد روزويل بارك التذكاري ، RPMI ؛ 10٪ FBS ؛ 1٪ N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid ، HEPES ؛ 1٪ بيروفات الصوديوم) مكمل ب IL-2 (100 U / ml). استزراع عند 37 درجة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ واستبداله بمتوسط 2-3 مرات أسبوعيا.

< p class = "jove_title" >4. تجميع طبقة ثنائية الدهون المستوية المدعومة بالزجاج

1. تحضير محلول سمكة المفترسة 100 مل عن طريق خلط 30٪ بيروكسيد الهيدروجين مع حمض الكبريتيك بنسبة 1: 3 في دورق
   ملاحظه: قم دائما بالعمل باستخدام عوامل ضارة مثل حامض الكبريتيك في غطاء دخان كيميائي مخصص بشكل صحيح.
2. في هذا الحل ، اغمر 2 غطاء مستطيل # 1.5 في محلول سمكة الضاري المفترسة لمدة 20-30 دقيقة
   ملاحظه: من الضروري تنظيف الأغطية بمحلول سمكة الضاري المفترسة.
3. أثناء تنظيف الأغطية ، خذ أنبوبا واحدا من دهون DOPC 400 ميكرومتر المعدة مسبقا وأنبوب واحد من دهون البيوتين PE المعدة مسبقا 80 ميكرومتر. انقلهم على الجليد إلى خزان الأرجون.
4. قم بإزاحة الأكسجين في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مع الأرجون ، ثم اجمع DOPC و Biotin-PE معا بنسبة 1: 1. سيختلف الحجم المحدد بناء على الاحتياجات التجريبية ولكن يجب أن يكون على الأقل 2 ميكرولتر لكل منهما. قم بإزاحة الأكسجين في أنبوب الخليط مرة أخرى بغاز الأرجون ، وأنابيب الكاشف الفردية أيضا ، قبل إعادة الأخير إلى الثلاجة.
5. بعد الانتهاء من التنظيف ، اشطف الأغطية جيدا بالماء المقطر. اضبط الغطاء ليجف في الهواء لبضع دقائق.
6. اسحب 1.5 ميكرولتر من خليط الجسيمات الشحمية المحضرة في الخطوة 5.4 وقم بتقطيعه في قطرة واحدة في إحدى غرف الممر في شريحة الغرفة. يعد استخدام 2 قطرات لكل حارة أمرا نموذجيا ، ولكنه ليس ضروريا.
7. ضع الغطاء الجاف بسرعة وكفاءة فوق القطرات. تأكد من أن القطرات متباعدة بدرجة كافية بحيث لا تندمج بمجرد وضع الغطاء. علاوة على ذلك ، تأكد من أن القطرات تظل دائرية ومحددة جيدا ، دون لمس حواف جدران الغرفة. اضغط لأسفل بقوة بين كل حارة وحولها لضمان إحكام تسرب الماء بين الغطاء والانزلاق.
8. حدد مواضع القطرات باستخدام قلم تحديد.
9. مرر 100 ميكرولتر من الكازين المائي بنسبة 5٪ عبر الغرفة لمنع الطبقة الثنائية. حاول التأكد من عدم وجود فقاعات في غرفة التدفق.
10. حقن 100 ميكرولتر من الستربتافيدين بتركيز 333 نانوغرام / مل في كل حارة. احتضن لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد ذلك ، اغسلها بتشغيل 3 مل من محلول ملحي مخمول بالأهب (HBS) / 1٪ ألبومين مصل بشري (HSA) في كل حارة لإزالة الستربتافيدين الزائد.
11. أضف 100 ميكرولتر من مضادات CD16 المصنفة بالفلورسنت الحيوي مثل Alexa Fluor 568 بتركيز البروتين الذي تم تحديده مسبقا ليكون أكثر فعالية. احتضن في الظلام لمدة 20-30 دقيقة. اغسل مرة أخرى عن طريق تشغيل 3 مل من HBS / 1٪ HSA عبر كل حارة.
12. قم بتدفق 100 ميكرولتر من D-biotin بتركيز 25 نانومتر عبر الغرفة من أجل ربط أي ستربتافيدين زائد وبالتالي القضاء على فرصة الارتباط غير المحدد للستربتافيدين بالخلايا.
13. عد الخلايا القاتلة الطبيعية وإعادة تعليقها بتركيز 500,000 / مل في HBS / 1٪ HSA.
14. أثناء تدوير الخلايا ، اغسل D-biotin خارج الغرفة ب 3 مل أخرى من HBS / 1٪ HSA لكل حارة.
15. تحقق من حركة الروابط على SLB عن طريق استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (استعادة التألق بعد التبييض الضوئي ، FRAP) على مضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) أو الفحص المجهري متحد البؤر قبل إضافة الخلايا القاتلة الطبيعية.
16. بمجرد انتهاء الخلايا من الدوران وإعادة تعليقها بالتركيز المطلوب ، أضف 100 ميكرولتر إلى كل حارة.
17. ضع الغرفة في حاضنة 37 درجة 5٪_CO2 لمدة 30-60 دقيقة.
18. بعد فترة الحضانة هذه ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد في RT لمدة 10-20 دقيقة.
19. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب (5٪ مصل حمار عادي و 0.2٪ Triton X-100 في PBS). احتضن في RT لمدة 30 دقيقة.
20. تلطيخ F-actin والبيرفورين عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الفالودين المخفف المسمى بالفلورسنت (1 وحدة / مل المسمى البالويدين) والجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للبيرفورين المسمى بالفلورسنت (500 نانوغرام / مل مضاد للبيرفورين mAb). احتضن في RT لمدة 1 ساعة.
21. يغسل عن طريق تشغيل 3 مل من PBS. الغرفة جاهزة للتصوير.

5. تصوير مشبك NK على طبقة ثنائية الدهون باستخدام STED

1. قم بتشغيل جميع وحدات الأجهزة الضرورية.
2. ابدأ تشغيل برنامج تحليل الصور. قم بتمكين كل من المسح بالرنين ووحدات STED. بعد إجراء هذه التحديدات ، انتظر حوالي 3-5 دقائق حتى يبدأ البرنامج.
3. انقر فوق علامة التبويب "التكوين" في الجزء العلوي من الشاشة.
4. حدد "تكوين الليزر" ثم قم بتشغيل الضوء الأبيض وليزر STED 592 نانومتر.
5. اختر الهدف 100x ، وقم بمحاذاة شعاع ليزر الإثارة مع ليزر استنفاد 592 نانومتر.
6. حدد وحدة "تكوين الليزر" ، وقم بإيقاف تشغيل ليزر النضوب 592 ، وقم بتشغيل ليزر النضوب 660 نانومتر.
7. ضع الشريحة على المسرح فوق العدسة. اجعل الخلايا المرتبطة بمنطقة الطبقة الثنائية المحددة في التركيز باستخدام مصباح الضوء الأبيض والعينات.
8. ارجع إلى علامة التبويب "الاستحواذ" ، مباشرة على يمين علامة التبويب "التكوين".
9. انقر فوق علامة التبويب "التبديل إلى الضوء الأبيض" ، ثم قم بتشغيل هذه الوحدة واسحب خط ليزر الإثارة إلى الطول الموجي المناسب.
10. حدد الكاشف المطلوب من قائمة تلك المتاحة ، ثم اضبط نطاق الكشف ليشمل النطاق المناسب للأطوال الموجية.
    ملاحظه: لا تضع نطاق الكشف مباشرة تحت شعاع الإثارة.
11. انقر فوق الزر "تسلسلي" في شريط الأدوات "اكتساب" الأيسر لإظهار مربع حوار المسح المتسلسل في الجزء السفلي من شريط الأدوات الأيسر. يتيح ذلك للمستخدم إضافة تسلسلات متعددة ، لكل منها شعاع إثارة مختلف للون مختلف. انقر فوق "بين الإطارات" ، ثم قم بتعيين تردد الإثارة والكاشف ونطاق الكشف لكل لون إضافي كما في الخطوتين 5.9 و 5.10.
12. بمجرد تحسين جميع الإعدادات ، اضغط على "ابدأ" لبدء عملية الاستحواذ.

المواد