تحضير عينة فحص السمية الخلوية بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية لتحليل قياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: McBride, J. E., et al. تحليل قياس التدفق الخلوي لنشاط الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم البشري الكامل. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو النشاط اللايتي للخلايا القاتلة الطبيعية ضد الخلايا المستهدفة الملطخة بالفلورسنت. تتيح هذه الطريقة قياس السمية الخلوية التي تسببها الخلايا القاتلة الطبيعية عن طريق تلطيخ الخلايا الميتة واستخدام مقياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا المستهدفة الحية والميتة.

البروتوكول

1. إعداد الضوابط

1. انقل ما يلي إلى أنابيب منفصلة وذات علامات مناسبة سعة 1.5 مل:
   1. أضف 500 ميكرولتر من IMDM الطازج الذي يحتوي على خلايا K562 المعلقة المسماة ب DiO في أنبوب "الإيجابي المزدوج" المسمى 1.5 مل.
   2. أضف 500 ميكرولتر من IMDM الطازج الذي يحتوي على خلايا K562 المعلقة المسمى DiO إلى أنبوب "DiO فقط" المسمى 1.5 مل.
   3. أضف 500 ميكرولتر من IMDM الطازج الذي يحتوي على خلايا K562 المعلقة غير المسماة إلى "بروبيديوم يوديد (PI) فقط" المسمى 1.5 مل.
2. ضع الأنابيب المزدوجة الإيجابية و PI فقط في حمام مائي 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. بعد انقضاء 5 دقائق ، قم بإزالة الأنابيب وامسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
4. أضف 10 لترا من PI إلى الأنابيب الإيجابية المزدوجة و PI 1.5 مل فقط.
5. ضع جميع عناصر التحكم الثلاثة في الخلية المستهدفة K562 في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
6. بعد انقضاء فترة الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قم بأجهزة الطرد المركزي جميع عناصر التحكم في الخلية المستهدفة الثلاثة K562 لمدة دقيقتين عند 163 × جم.
7. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية.
8. أعد تعليق كل عنصر تحكم ب 20 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا IMDM الطازجة ، واتركها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة على الأقل للحصول على إشارة DiO المثلى.
   ملاحظه: أصبحت عناصر التحكم جاهزة الآن للتشغيل من خلال مقياس تدفق التصوير.

< p class = "jove_title" >2. تحضير عينة فحص السمية الخلوية

1. قم بإعداد وتسمية أنابيب 1.5 مل لكل عينة / مشارك وفقا لذلك.
2. أرادت الماصة نسبة الخلايا القاتلة الطبيعية وخلايا K562 المسمى DiO في كل أنبوب.
   ملاحظة: على سبيل المثال، النسبة المطلوبة للخلايا المستهدفة K562 وخلايا المستجيب NK هي 1:5.
3. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 135 × جم.
4. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية.
5. أعد تعليق خليط الخلايا K562 المسمى NK-DiO في 500 ميكرولتر من وسائط الخلايا القاتلة الطبيعية بدون إنترلوكين -2 (IL-2) و 2-mercaptoethanol (2-ME) (وسائط زراعة الخلايا NK غير المكتملة).
   ملاحظة: وسائط زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية غير المكتملة هي الحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي مع بيكربونات الصوديوم ، بدون L-الجلوتامين ، والريبونوكليوسيدات ، وديوكسي ريبونوكليوسيدات.
6. أضف 5 ميكرولتر من PI لكل أنبوب.
7. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 163 × جم.
8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
9. بعد حضانة 2 ساعة ، جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 163 × جم.
10. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية.
11. أعد تعليق الخلايا في وسائط زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية غير المكتملة سعة 25 ميكرولتر.

< p class = "jove_title" >3. تحضير عينة عفوية ("S")

1. الماصة 500 ميكرولتر من خلايا K562 المسماة ب DiO (تركيز 1 × 106 خلية / مل) في أنبوب سعة 1.5 مل.
2. أضف 10 ميكرولتر من PI إلى كل أنبوب.
3. أنبوب الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 163 × جم.
4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
5. بعد حضانة 2 ساعة ، جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 163 × جم.
6. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية.
7. أعد تعليق الخلايا في 25 ميكرولتر غير مكتملة من وسط ألفا الأساسي (α-MEM).

فئة

4. الحصول على البيانات باستخدام مقياس تدفق التصوير

الخلوي

1. اضغط على الزر الأخضر الموجود داخل الباب الأمامي لمقياس تدفق التصوير الخلوي لتشغيل الجهاز.
2. قم بتشغيل جميع أجهزة الكمبيوتر المرتبطة بمقياس تدفق التصوير.
3. قم بتشغيل برنامج مقياس التدفق الخلوي للتصوير.
4. انقر فوق الزر "بدء التشغيل" لمسح النظام وإعداد خط العينة.
5. بمجرد اكتمال "بدء التشغيل" ، أغلق نافذة "المعايرة".
6. تعيين القنوات: في أعلى الجانب الأيسر ، انقر فوق كل قناة لتعيينها.
7. على الجانب الأيمن ، انقر فوق زر مخطط المبعثر لإنشاء 4 مخططات مبعثرة: Raw Max Pixel _MC_6 مقابل Area_M06 و Raw Max Pixel _MC_2 مقابل Area_M02 و Raw Max Pixel _MC_5 مقابل Area_M05 و FieldArea_M01 مقابل AspectRatio_M01.
8. ابدأ في تحليل العينات باستخدام عنصر التحكم "الإيجابي المزدوج" أولا.
   1. انقر فوق "تحميل".
   2. ضع الأنبوب سعة 1.5 مل مع العينة "الإيجابية المزدوجة" من الخطوات 1.4 إلى 1.8 في محمل العينة.
   3. حدد هدف 40X ضمن علامة التبويب "التكبير".
   4. قم بتشغيل ليزر 405 ميجاوات و 642 ميجاوات.
   5. قم بتشغيل قناة "Brightfield".
   6. انقر فوق "تحديد الكثافة".
   7. بناء على عينة التحكم "الإيجابية المزدوجة" ، حدد الكثافة المطلوبة لليزر 405 ميجاوات حتى لا يتم تحميل الكاشف بشكل زائد.
      ملاحظه: على سبيل المثال ، تم تعيين الكثافة المثلى لهذه التجربة عند 11 ميجاوات.
9. بعد تحقيق الإعداد المطلوب ، احصل على البيانات.
   1. ضمن علامة التبويب "الحصول على الملفات"، أدخل نص اسم ملف مخصصا. حدد مجلدا لحفظ ملف (ملفات) البيانات.
   2. أدخل عدد الخلايا التي تريد الحصول عليها بجوار "تجميع". عادة ما يتراوح هذا الرقم بين 1,000 إلى 10,000.
   3. انقر فوق "اكتساب"
      ملاحظة: بمجرد الحصول على العدد المطلوب من الخلايا، يتم حفظ ملف البيانات تلقائيا في المجلد المحدد مسبقا.
10. بعد انتهاء الاستحواذ، قم بتحميل عينة التحكم التالية - تحكم DiO فقط.
    1. انقر فوق "تحميل".
    2. ضع الأنبوب سعة 1.5 مل مع عينة "DiO فقط" في محمل العينات.
    3. اترك هدف 40X ضمن علامة التبويب "التكبير" محددا.
    4. اترك ليزر 405 ميجاوات قيد التشغيل.
    5. قم بإيقاف تشغيل ليزر 642 ميجاوات وقناة "Brightfield".
       ملاحظة: الآن بعد أن تم تحقيق الإعداد المطلوب ، يمكن الحصول على البيانات.
    6. ضمن علامة التبويب "الحصول على الملفات" ، أدخل نص اسم ملف مخصصا وحدد مجلدا لحفظ ملف (ملفات) البيانات. أدخل عدد الخلايا التي تريد الحصول عليها بجوار "تجميع". عادة ما يكون هذا الرقم 1,000.
    7. انقر فوق "اكتساب"
       ملاحظه: بمجرد الحصول على العدد المطلوب من الخلايا ، يتم حفظ ملف البيانات تلقائيا في المجلد المحدد مسبقا.
11. كرر الخطوة 4.10 لعينة التحكم "PI فقط". العينات التجريبية جاهزة الآن للجمع.
12. تعامل مع العينات التجريبية المتبقية ، بما في ذلك "عينات "S" العفوية" على النحو التالي:
    1. اترك هدف 40X ضمن علامة التبويب "التكبير" محددا.
    2. قم بتشغيل ليزر 405 ميجاوات و 642 ميجاوات.
    3. قم بتشغيل قناة "Brightfield".
    4. انقر فوق "ضبط الكثافة".
    5. ضمن علامة التبويب "الحصول على الملفات" ، أدخل نص اسم ملف مخصصا وحدد مجلدا لحفظ ملف (ملفات) البيانات. أدخل نص اسم ملف مخصص.
    6. أدخل عدد الخلايا التي تريد الحصول عليها بجوار "تجميع".
    7. انقر فوق الزر "اكتساب".
       ملاحظه: بمجرد الحصول على العدد المطلوب من الخلايا ، يتم حفظ ملف البيانات تلقائيا في المجلد المحدد مسبقا.
13. كرر الخطوة 4.12 لجميع العينات التجريبية.
14. بعد جمع جميع البيانات والملفات التجريبية ، انقر فوق الزر "إيقاف التشغيل" لتعقيم النظام.

< p class = "jove_title" >5. تحليل عينة مقياس التدفق الخلوي للتصوير

1. افتح تطبيق برنامج تحليل مقياس التدفق الخلوي للتصوير.
2. ضمن "ملف"، افتح تجريبيا. ملف REF.
3. قم ببناء مصفوفة جديدة باستخدام لون واحد. ملفات RIF (التحكم في DiO فقط والتحكم PI فقط، الذي تم إنشاؤه خلال الخطوتين 4.10 و4.11) عن طريق تحديد "إنشاء مصفوفة جديدة" ضمن علامة التبويب "التعويض" في برنامج مقياس التدفق الخلوي للتصوير.
   ملاحظة: سيطلب البرنامج تحديد ملفات اللون الفردي ودمجها لإنشاء ملف مصفوفة (امتداد ملف .ctm) ، والذي سيتم تحديده لتطبيق تعويض القناة.
4. قم بإنشاء مخططات نقطية باستخدام وظيفة "اللبنات الأساسية" للبرنامج.
   1. قم بإنشاء مخطط نقطي (BrightFieldGradient_RMS مقابل التردد) لبوابة الخلايا المركزة. أطلق على البوابة اسم "التركيز" (الشكل 1 أ).
   2. باستخدام بوابة "التركيز" ، قم بإنشاء مخطط نقطي لمنطقة المجال الساطع مقابل نسبة العرض إلى الارتفاع للمجال الساطع لبوابة الخلايا المفردة. أطلق على البوابة اسم "مفردة" (الشكل 1 ب).
   3. باستخدام البوابة "المفردة" ، قم بإنشاء مخطط نقطي من Intensity_MC_Ch02 مقابل Intensity_MC_Ch5. استخدم هذه المؤامرة لتحديد وبوابة الخلايا الموجبة فقط ل DiO (الأهداف ، على قيد الحياة) وخلايا PI-DiO الإيجابية المزدوجة (الأهداف ، الميتة) (الشكل 1C).
      ملاحظه: يمكن إنشاء جميع المخططات الموضحة في الخطوات 5.4.1 و 5.4.2 و 5.4.3 باستخدام وظيفة "اللبنات الأساسية" للبرنامج.
5. انقر فوق وظيفة الإحصائيات الخاصة بالمخطط النقطي للوصول إلى أرقام الخلايا لكل بوابة.
6. احسب النسبة المئوية للأهداف الميتة في العينة التلقائية والعينات التجريبية باستخدام الصيغة التالية:
   النسبة المئوية للأهداف الميتة في العينة = (#dead الأهداف × 100) / (#live الأهداف + #dead الأهداف)
7. احسب السمية الخلوية باستخدام الصيغة التالية:
   النسبة المئوية للسمية الخلوية = [(ميت تلقائي تجريبي) / (100 ميت تلقائي)] × 100

النتائج

الشكل 1: الرسوم البيانية التمثيلية ، ومخططات المبعثر ، والصور لتحليل النشاط السام للخلايا. (أ) تحليل خلايا التركيز. (ب) تحليل الخلية الواحدة. (ج) تحليل تلطيخ الخلايا المستهدفة. يتم اتخاذ جميع القرارات باستخدام الصورة المرفقة بكل حدث. يمكن الوصول إلى هذا في برنامج التحليل ببساطة عن طريق النقر على الحدث الموجود على الرسوم البيانية. (د)...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات K-562 الخلايا الليمفاوية ATCC سي سي إل -243 وسائط Dulbecco المعدلة في Iscove ATCC 30-2005 نسبة عالية من الجلوكوز ، مع L-Glutamine ، مع HEPES ، مصفى معقم ألفا الحد الأدنى من الوسيط الأساسي ATCC CRL-2407 بدون ريبونوكليوسيدات وديوكسي ريبونوكليوسيدات ولكن مع 2 ملي مولار من الجلوتامين و 1.5 جم / لتر بيكربونات الصوديوم محلول تلطيخ بروبريديوم يوديد BD Pharmingen 51-66211ه حل وضع العلامات على الخلايا Vybranto DiO فيبرانتو [ف-22886] مقياس التدفق الخلوي للتصوير ImageStream X Mark II الدم الكامل CD56 MicroBeads ، الإنسان ميلتيني بيوتيك 130-090-875 مقياس التدفق الخلوي للتصوير ImageStream X Mark II EMD ميليبور خرز السرعة شركة أمنس 400030 برنامج INSPIRE EMD ميليبور الإصدار مارك الثاني، أيلول/سبتمبر 2013 برامج تطبيقات الأفكار EMD ميليبور الإصدار 6.1 ، يوليو 2014