تحضير شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة على الاغاروز

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Neuhaus ، V. et al. ، تقييم التأثيرات السامة للخلايا والمناعية للمواد في شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نصف إجراء لتضخيم الرئتين البشرية المعزولات بالأغالروز وإعداد شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة. يمكن استخدام شرائح الرئة المحضرة خارج الجسم الحي لمزيد من التجارب المناعية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. التحضير العام ل PCLS البشري والتعرض اللاحق للمواد الكيميائية

ملاحظة: مطلوب شخصين لملء الرئة. يوصى بسجل تطعيم محدث لالتهاب الكبد A و B. يتم فحص المرضى بشكل روتيني بحثا عن فيروس التهاب الكبد C وفيروس نقص المناعة البشرية قبل زرع الرئة. إذا تم تشخيص أو الاشتباه في وجود عدوى نشطة بالمتفطرة السلية ، فيجب رفض الرئة. ومع ذلك ، يجب التعامل مع جميع أنسجة الرئة البشرية الطازجة والعينات المشتقة منها على أنها يحتمل أن تكون معدية ، ويجب اتخاذ تدابير وقائية مقابلة (أقنعة مرشح الجسيمات (FFP2) ، نظارات واقية ، قفازات) لضمان السلامة المهنية للموظفين. يستغرق الإجراء 60-90 دقيقة.

1. تأكد من سلامة فص الرئة البشري.
   ملاحظه: يمنع التمزق في غشاء الجنب ملء الأنسجة المتجانسة. يجب أن تكون مادة الرئة البشرية من يوم الاستئصال. يتم التسامح مع فترات التخزين التي تبلغ حوالي 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل ملئها بالأغالروز على الجليد. يتم الحصول على الأنسجة التي نستخدمها في هذا البروتوكول من المرضى الذين يخضعون للاستئصال. إنه ليس من المرضى المتوفين. إذا تم تخزين الأنسجة على الجليد ، فقم بتسخينها مسبقا إلى RT قبل ملئها ، وإلا فسوف يتبلمر الاغاروز على الفور ، ولن يكون من الممكن حشو متجانس.
   أنذر: تأكد من أن جميع الأشخاص الذين يتعاملون مع المواد البشرية الأصلية يرتدون ملابس واقية تتكون من معطف مختبر ، وزوجين من القفازات ، وقبعة ، وقناع للوجه ، وزوج من نظارات السلامة. من المحتمل أن تكون المواد البشرية معدية.
2. يزن 7.5 جم من الاغاروز منخفض التبلور وأضفه إلى 250 مل من الماء المقطر ثنائي التبلور. اسلقي الاغاروز في الميكروويف حتى يذوب الاغاروز. قم بتبريده إلى حوالي 40 درجة مئوية ، اعتمادا على نقطة انصهار وتبلور الاغاروز.
   ملاحظه: مطلوب عدة قوارير ، اعتمادا على حجم الفص.
3. قم بالتسخين المسبق واحتفظ بوسط الاستزراع (جدول المواد) عند 37 درجة مئوية < br / > ملاحظه: إذا كان الاغاروز ساخنا جدا ، فإن الفيتامينات الموجودة في وسط الاستزراع ستفقد فعاليتها وستتلف الخلايا. إذا كانت درجة حرارة محلول المتوسط / الاغاروز أقل من 37 درجة مئوية ، فستبدأ عملية التبلور وتضعف الحشو المتجانس للرئة. يوصى فقط بنطاق درجة حرارة من 37 درجة مئوية إلى 39 درجة مئوية.
4. ضع جميع المواد المطلوبة في متناول اليد قبل البدء: 5-10 مشابك ، قسطرة مرنة بطول 1 متر تقريبا ، حقنة مناسبة (على سبيل المثال ، 50 مل) مناسبة للاتصال بالقسطرة ، وصندوق ثلج مملوء بالثلج.
5. قم بتدوير القصبة الهوائية / القصبة الهوائية الرئيسية عن طريق إدخال أنبوب السيليكون وتثبيته بمشبك موجه بالتوازي مع الأنبوب ، بحيث يضغط المشبك على الأنسجة معا بجانب أنبوب السيليكون دون الضغط عليه. تحقق من أن أنبوب السيليكون مثبت بالداخل ولا يمكن أن ينزلق أثناء إجراء التعبئة. أغلق جميع الشعب الهوائية والأوعية الدموية والإصابات الأخرى باستخدام المشابك ، حتى لا يتسرب أي من الاغاروز أثناء إجراء الحشو.
6. امزج حجما مكافئا بنسبة 3٪ من الاغاروز منخفض التبلور مع وسط الاستزراع في دورق غرس الخليط في الرئة باستخدام حقنة سعة 50 مل. قبل إعادة ملء المحقنة بوسط ، أغلق القسطرة بالأصابع أو المشبك لتجنب فقاعات الهواء وارتجاع الاغاروز. املأ فص الرئة حتى ينتفخ بالكامل. المس بعناية غشاء الجنب الرئوي على الجانب. يجب أن يكون غشاء الجنب متساويا وصعبا.
   ملاحظه: اعتمادا على حجم فص الرئة ، يمكن أن تكون هناك حاجة إلى ما يصل إلى 2 أو 3 لتر من محلول الاغاروز / المتوسط.
7. كرر الخطوات 1.5 - 1.6 لكل قصبات هوائية في حالة وجود عدة قصبات هوائية داخل عينة واحدة.
8. ضع الرئة على الجليد لبلمرة الاغاروز إلى هلام لمدة 20-40 دقيقة ، اعتمادا على كمية الاغاروز المغرس. المس غشاء الجنب بعناية من عدة جوانب للتحقق مما إذا كان صلبا وباردا ، مما يشير إلى أن البلمرة قد اكتملت ، وإلا استمر في الانتظار. دع علماء الأمراض يقطعون الرئة إلى شرائح ، ويأخذون عيناتهم ، ويخزنون مادة الرئة على الجليد لنقلها.
9. قطع أنسجة الرئة البشرية إلى ألواح 3-5 سم بسكين حاد.
   ملاحظه: استخدم شفرة جديدة لكل رئة لضمان الحدة.
10. املأ قطاعة الأنسجة بمحلول ملح إيرل المتوازن المثلج (EBSS) سعة 400 مل. قم بقطع نوى الأنسجة الأسطوانية على الفور من ألواح الرئة باستخدام مفك براغي شبه آلي مع أداة حفر بالقطر المفضل (على سبيل المثال ، 8 مم ؛ 10 مم).
    ملاحظه: يجب أن يكون هذا القطر مكافئا لقطر حامل المناديل داخل الجهاز.
11. اضبط سمك شرائح الرئة على قيمة السماكة المطلوبة.
    ملاحظه: يشيع استخدام سمك 250 ميكرومتر تقريبا في تجارب PCLS. توصي الشركة المصنعة لقطاعة الأنسجة بمقياس سمك شريحة الأنسجة للتحقق من سمك الشريحة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام تلطيخ التثبيت الكامل جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر لتحديد سمك الشريحة.
12. انقل قلب الأنسجة إلى حامل الأنسجة في قطاعة الأنسجة. ضع الوزن (جزء من حامل الأنسجة) أعلى قلب الأنسجة. اضبط سرعة الذراع وسرعة الشفرة على 6 على قطاعة الأنسجة. ابدأ في تقطيع قلب الأنسجة إلى PCLS.
13. مكمل 500 مل من وسط النسر المعدل المتاح تجاريا من Dulbecco (DMEM): خليط المغذيات F-12 DMEM / F12 (1: 1) مع 5 مل من البنسلين (10,000 وحدة / مل) والستربتومايسين (10,000 ميكروغرام / مل). قم بتخزين وسط الثقافة لعدة أيام في ظروف معقمة في الثلاجة. قم بتسخين الحجم المطلوب فقط للمتوسط.
    ملاحظه: سيتم تعطيل البنسلين إذا تم الاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية لفترات أطول. استخدم وسط مزرعة خال من المصل وخالي من الصبغة ، حيث يختلف تكوين المصل من دفعة إلى أخرى ، ويمكن أن تتداخل الأصباغ ، مثل الفينول الأحمر ، مع المقايسات.
14. املأ طبق بتري (100 × 15 مم) بوسط استزراع مثلج 25 مل. يجب تصريف الوسيط من قطاعة الأنسجة إلى دورق عن طريق فتح مشبك الأسطوانة الزجاجية. انقل الشرائح من دورق إلى طبق بتري بوسط استزراع باستخدام قضيب (على سبيل المثال ، حلقة التلقيح). ضع طبق بتري في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 100٪ رطوبة). اترك الوسط يسخن قبل خطوات الغسيل.
    ملاحظه: يتم تنفيذ جميع الخطوات الإضافية في ظل ظروف معقمة.
15. ضع مصفاة خلوية في طبق بتري لغسل PCLS. قم بإزالة وسط الاستزراع تماما باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل من خلال مصفاة الخلية وأضف 25 مل من الوسط الطازج المسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 3-4 مرات كل 30 دقيقة.
    ملاحظه: تمنع مصفاة الخلية امتصاص الشرائح في الماصة لتجنب أي ضرر للشرائح.
16. انقل شرائح الرئة بعناية إلى صفيحة استزراع 24 بئرا بحد أدنى 500 ميكرولتر وسط استزراع لشريحتين لكل بئر.
    ملاحظه: للنقل ، يفضل استخدام حلقة التلقيح وترك الشرائح تطفو على الحلقة لمنع تلف الأنسجة. ليست هناك حاجة إلى مزيد من الفصل بين الشرائح ، لأن النقص في الوسط الطازج الكافي فقط هو الذي سيؤدي إلى موت الخلايا في شرائح الأنسجة. يمكن أن تتداخل الشرائح أو تلمس بعضها البعض في البئر: هذا ليس له أي تأثير على صلاحية الأنسجة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خرطوم سيليكون 3.0 × 5.0 مم أ. هارتنشتاين (لايبزيغ ، ألمانيا) SS04 حقنة علوم مختبر فاوست (كليتجاو ، ألمانيا) 9.410 050 أدوات الحفر حسب الطلب حسب الطلب مقبض شفرة التشذيب (FEATHER) pfm medical ag (كولونيا ، ألمانيا) 205530001 شفرات التشذيب (FEATHER) pfm medical ag (كولونيا ، ألمانيا) 205500000 ميكروتوم: قطاعة الأنسجة ألاباما للبحث والتطوير (باد هومبورغ ، ألمانيا) 303400-ADPT قطاعة مناديل كرومديك (MD6000) شفرة ميكروتوم سيف ويلكنسون (سولينجن ، ألمانيا) ENR-4027800011506 أطباق زراعة الأنسجة سيجما (ميونيخ ، ألمانيا) Z666246-420 إيه حلقة التلقيح تشخيص كوبان (موريتا ، الولايات المتحدة الأمريكية) CD176S01 لوحات زراعة الأنسجة TPP 24wells سيجما (ميونيخ ، ألمانيا) Z707791-126 إيه كاسيت Thermo Scientific (Schwerte ، ألمانيا) 1000957 Nunc MaxiSorp مسطح القاع شركة Fisher Scientific GmbH (هانوفر ، ألمانيا) 44-2404-21 نونك مايكروويل 96 - بئر Thermo Scientific (Schwerte ، ألمانيا) 260836 الكواشف الاغاروز ، درجة حرارة التبلور المنخفضة سيجما (ميونيخ ، ألمانيا) أ 9414-100 جرام مخاليط ومحاليل الملح المتوازنة ، زراعة الخلايا ، الوسائط والأملاح الكلاسيكية ، أملاح إيرل المتوازنة (EBSS) سيجما (ميونيخ ، ألمانيا) E2888-500 مل البنسلين والستربتومايسين لونزا (فيرفييه ، بلجيكا) 17-602 [إ] خليط المغذيات المتوسطة من Dulbecco Modified Eagle F-12 Ham (DMEM F-12) جيبكو (دارمشتات ، ألمانيا) هاتف: 11039-047 وسط الثقافة فوسفات دولبيكو مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS) لونزا (فيرفييه ، بلجيكا) BE17-513F