تقييم السمية الخلوية وسلامة الغشاء في شرائح الرئة عن طريق فحص نازعة هيدروجين اللاكتات

الملخص

المصدر: Neuhaus, V., et al. تقييم التأثيرات السامة للخلايا والمناعية للمواد في شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو مقايسة نازعة هيدروجين اللاكتات LDH لقياس التأثير السام للخلايا لمادة الاختبار وتأثيرها على سلامة الغشاء في شرائح الرئة البشرية المقطوعة بدقة. يوفر الاختبار مقياسا كميا لموت الخلايا أو تلفها في العينة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد

< p class = "jove_title" >1. التحضير العام ل PCLS البشري والتعرض اللاحق للمواد الكيميائية

ملاحظة: مطلوب شخصين لملء الرئة. يوصى بسجل تطعيم محدث لالتهاب الكبد A و B. يتم فحص المرضى بشكل روتيني بحثا عن فيروس التهاب الكبد C وفيروس نقص المناعة البشرية قبل زرع الرئة. إذا تم تشخيص أو الاشتباه في وجود عدوى نشطة بالمتفطرة السلية ، فيجب رفض الرئة. ومع ذلك ، يجب التعامل مع جميع أنسجة الرئة البشرية الطازجة والعينات المشتقة منها على أنها يحتمل أن تكون معدية ، ويجب اتخاذ تدابير وقائية مقابلة (أقنعة مرشح الجسيمات (FFP2) ، نظارات واقية ، قفازات) لضمان السلامة المهنية للموظفين. يستغرق الإجراء 60-90 دقيقة.

1. تأكد من سلامة فص الرئة البشري.
   ملاحظه: يمنع التمزق في غشاء الجنب ملء الأنسجة المتجانسة. يجب أن تكون مادة الرئة البشرية من يوم الاستئصال. يتم التسامح مع فترات التخزين التي تبلغ حوالي 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل ملئها بالأغالروز على الجليد. يتم الحصول على الأنسجة التي نستخدمها في هذا البروتوكول من المرضى الذين يخضعون للاستئصال. إنه ليس من المرضى المتوفين. إذا تم تخزين الأنسجة على الجليد ، فقم بتسخينها مسبقا إلى RT قبل ملئها ، وإلا فسوف يتبلمر الاغاروز على الفور ، ولن يكون من الممكن حشو متجانس.
   أنذر: تأكد من أن جميع الأشخاص الذين يتعاملون مع المواد البشرية الأصلية يرتدون ملابس واقية تتكون من معطف مختبر ، وزوجين من القفازات ، وقبعة ، وقناع للوجه ، وزوج من نظارات السلامة. من المحتمل أن تكون المواد البشرية معدية.
2. يزن 7.5 جم من الاغاروز منخفض التبلور وأضفه إلى 250 مل من الماء المقطر ثنائي التبلور. اسلقي الاغاروز في الميكروويف حتى يذوب الاغاروز. قم بتبريده إلى حوالي 40 درجة مئوية ، اعتمادا على نقطة انصهار وتبلور الاغاروز.
   ملاحظه: مطلوب عدة قوارير ، اعتمادا على حجم الفص.
3. قم بالتسخين المسبق واحتفظ بوسط الاستزراع (جدول المواد) عند 37 درجة مئوية < br / > ملاحظه: إذا كان الاغاروز ساخنا جدا ، فإن الفيتامينات الموجودة في وسط الاستزراع ستفقد فعاليتها وستتلف الخلايا. إذا كانت درجة حرارة محلول المتوسط / الاغاروز أقل من 37 درجة مئوية ، فستبدأ عملية التبلور وتضعف الحشو المتجانس للرئة. يوصى فقط بنطاق درجة حرارة من 37 درجة مئوية إلى 39 درجة مئوية.
4. ضع جميع المواد المطلوبة في متناول اليد قبل البدء: 5-10 مشابك ، قسطرة مرنة بطول 1 متر تقريبا ، حقنة مناسبة (على سبيل المثال ، 50 مل) مناسبة للاتصال بالقسطرة ، وصندوق ثلج مملوء بالثلج.
5. قم بتدوير القصبة الهوائية / القصبة الهوائية الرئيسية عن طريق إدخال أنبوب السيليكون وتثبيته بمشبك موجه بالتوازي مع الأنبوب ، بحيث يضغط المشبك على الأنسجة معا بجانب أنبوب السيليكون دون الضغط عليه. تحقق من أن أنبوب السيليكون مثبت بالداخل ولا يمكن أن ينزلق أثناء إجراء التعبئة. أغلق جميع الشعب الهوائية والأوعية الدموية والإصابات الأخرى باستخدام المشابك ، حتى لا يتسرب أي من الاغاروز أثناء إجراء الحشو.
6. امزج حجما مكافئا بنسبة 3٪ من الاغاروز منخفض التبلور مع وسط الاستزراع في دورق غرس الخليط في الرئة باستخدام حقنة سعة 50 مل. قبل إعادة ملء المحقنة بوسط ، أغلق القسطرة بالأصابع أو المشبك لتجنب فقاعات الهواء وارتجاع الاغاروز. املأ فص الرئة حتى ينتفخ بالكامل. المس بعناية غشاء الجنب الرئوي على الجانب. يجب أن يكون غشاء الجنب متساويا وصعبا.
   ملاحظه: اعتمادا على حجم فص الرئة ، يمكن أن تكون هناك حاجة إلى ما يصل إلى 2 أو 3 لتر من محلول الاغاروز / المتوسط.
7. كرر الخطوات 1.5 - 1.6 لكل قصبات هوائية في حالة وجود عدة قصبات هوائية داخل عينة واحدة.
8. ضع الرئة على الجليد لبلمرة الاغاروز إلى هلام لمدة 20-40 دقيقة ، اعتمادا على كمية الاغاروز المغرس. المس غشاء الجنب بعناية من عدة جوانب للتحقق مما إذا كان صلبا وباردا ، مما يشير إلى أن البلمرة قد اكتملت ، وإلا استمر في الانتظار. سيقوم علماء الأمراض بتقطيع الرئة إلى شرائح ، وأخذ عيناتهم ، وتخزين مادة الرئة على الجليد لنقلها.
9. قطع أنسجة الرئة البشرية إلى ألواح 3-5 سم بسكين حاد.
   ملاحظه: استخدم شفرة جديدة لكل رئة لضمان الحدة.
10. املأ قطاعة الأنسجة بمحلول ملح إيرل المتوازن المثلج (EBSS) سعة 400 مل. قم بقطع نوى الأنسجة الأسطوانية على الفور من ألواح الرئة باستخدام مفك براغي شبه آلي مع أداة حفر بالقطر المفضل (على سبيل المثال ، 8 مم ؛ 10 مم).
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا القطر مكافئا لقطر حامل المناديل داخل الجهاز.
11. اضبط سمك شرائح الرئة على قيمة السماكة المطلوبة.
    ملاحظه: يشيع استخدام سمك 250 ميكرومتر تقريبا في تجارب PCLS. توصي الشركة المصنعة لقطاعة الأنسجة بمقياس سمك شريحة الأنسجة للتحقق من سمك الشريحة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام تلطيخ التثبيت الكامل جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر لتحديد سمك الشريحة كما هو موضح من قبل Brismar et al.27
12. انقل قلب الأنسجة إلى حامل الأنسجة في قطاعة الأنسجة. ضع الوزن (جزء من حامل الأنسجة) أعلى قلب الأنسجة. اضبط سرعة الذراع وسرعة الشفرة على 6 على قطاعة الأنسجة. ابدأ في تقطيع قلب الأنسجة إلى PCLS.
13. مكمل 500 مل من وسط النسر المعدل المتاح تجاريا من Dulbecco (DMEM): خليط المغذيات F-12 DMEM / F12 (1: 1) مع 5 مل من البنسلين (10,000 وحدة / مل) والستربتومايسين (10,000 ميكروغرام / مل). قم بتخزين وسط الثقافة لعدة أيام في ظروف معقمة في الثلاجة. قم بتسخين الحجم المطلوب فقط للمتوسط.
    ملاحظه: سيتم تعطيل البنسلين إذا تم الاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية لفترات أطول. استخدم وسط مزرعة خال من المصل وخالي من الصبغة ، حيث يختلف تكوين المصل من دفعة إلى أخرى ، ويمكن أن تتداخل الأصباغ ، مثل الفينول الأحمر ، مع المقايسات.
14. املأ طبق بتري (100 × 15 مم) بوسط استزراع مثلج 25 مل. يجب تصريف الوسيط من قطاعة الأنسجة إلى دورق عن طريق فتح مشبك الأسطوانة الزجاجية. انقل الشرائح من دورق إلى طبق بتري بوسط استزراع باستخدام قضيب (على سبيل المثال ، حلقة التلقيح). ضع طبق بتري في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، 100٪ رطوبة). اترك الوسط يسخن قبل خطوات الغسيل.
    ملاحظه: يتم تنفيذ جميع الخطوات الإضافية في ظل ظروف معقمة.
15. ضع مصفاة خلوية في طبق بتري لغسل PCLS. قم بإزالة وسط الاستزراع تماما باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل من خلال مصفاة الخلية وأضف 25 مل من الوسط الطازج المسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 3-4 مرات كل 30 دقيقة.
    ملاحظه: تمنع مصفاة الخلية امتصاص الشرائح في الماصة لتجنب أي ضرر للشرائح.
16. انقل شرائح الرئة بعناية إلى صفيحة ثقافة سعة 24 بئرا بحد أدنى 500 ميكرولتر وسط استزراع لشريحتين لكل بئر. تعريض أنسجة الرئة للمواد (انظر الخطوات 3.1 - 3.4) ، على سبيل المثال ، لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    ملاحظه: للنقل ، يفضل استخدام حلقة التلقيح وترك الشرائح تطفو على الحلقة لمنع تلف الأنسجة. ليست هناك حاجة إلى مزيد من الفصل بين الشرائح ، لأن النقص في الوسط الطازج الكافي فقط هو الذي سيؤدي إلى موت الخلايا في شرائح الأنسجة. يمكن أن تتداخل الشرائح أو تلمس بعضها البعض في البئر: هذا ليس له أي تأثير على صلاحية الأنسجة.
17. ضع جميع المواد البشرية المتبقية في قارورة بلاستيكية مع مثبت (على سبيل المثال ، 10٪ فورمالديهايد مخزن مؤقتا) لمدة 24 ساعة على الأقل وحرقها في عملية التخلص.
    تحذير: الفورمالديهايد سام ، قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء المحرك.

< p class = "jove_title" >2. تحضير المحاليل للمواد

ملاحظة: قم بإعداد حلول العمل وأدوات التحكم مباشرة قبل الاستخدام.

Caution: تعامل مع المواد وفقا لتعليمات السلامة أو ، إذا لم تكن معروفة ، على أنها قد تكون ضارة واتبع احتياطات السلامة الروتينية.

1. قم بإذابة المواد القابلة للذوبان في الماء مباشرة في وسط الزراعة. بالنسبة للمواد الكيميائية غير القابلة للذوبان أو ضعيفة الذوبان ، قم أولا بإذابة المادة في المذيبات المناسبة اعتمادا على قابلية ذوبان المادة. يمكن إذابة المواد ذات الذوبان المحدود في الماء (<0.1 مجم / مل) ، على سبيل المثال ، في DMSO أو الإيثانول. يجب تحديد تركيزات المذيبات غير السامة عن طريق المعايرة بالتحليل الحجمي مسبقا. تأكد من أن المواد لا تترسب من المحلول عند تخفيفها في الوسط.
   ملاحظه: يتم تحضير محاليل HClPt وكبريتات لوريث الصوديوم (SLS).
2. قم بإعداد محاليل مخزون المواد بمقدار 100 ضعف أعلى تركيز مطلوب في وسط الاستزراع أو المذيب. تزن 12.5 مجم حمض الهيدروكلوريك و 34.4 مجم SLS وقم بإعداد محاليل المخزون عن طريق إذابة المواد الكيميائية في وسط ثقافة 1 مل < br / > ملاحظه: لا يلزم وجود مذيب لهذه المواد الكيميائية.
3. قم بإعداد تخفيف نهائي بنسبة 1: 100 في وسط دافئ مسبقا. في حالة الاستخدام المسبق للمذيب ، ينتج عن هذا النهج نفس تركيز المذيب النهائي لجميع تركيزات المواد.
4. استخدم تركيز المذيب النهائي (على سبيل المثال ، 1٪ كما هو موضح في الخطوة 2.3) للمعالجة المرجعية ل PCLS. لم تكن هناك حاجة إلى التحكم في المذيبات للمواد الكيميائية المذكورة في قسم النتائج.

< p class = "jove_title" >3. المراجع الإيجابية والسلبية لمقايسات السمية الخلوية

1. لجميع فحوصات الجدوى ، قم بإعداد عناصر التحكم الإيجابية والسلبية التالية:
   1. التحكم في الأنسجة: احتضان PCLS في وسط مزرعة فقط كمرجع ل PCLS غير المعالجة لمدة 24 ساعة في ظروف زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 100٪ رطوبة).
   2. التحكم في السيارة (إذا لزم الأمر): احتضان PCLS بتركيز المذيب النهائي كمرجع ل PCLS المعالجة بالمركبة فقط (انظر الخطوة 1.4) لمدة 24 ساعة في ظروف زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، 100٪ رطوبة).
   3. التحكم الإيجابي: احتضان PCLS بمنظف 1٪ في محلول عازل لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية
      ملاحظه: إذا أصبح PCLS عديم اللون ، فإن الأنسجة ميتة. يتم تحديد نازعة هيدروجين L-lactate الكلية (LDH) في المادة الطافية ، مع امتصاص حوالي 1.9 - 2.3 (انظر الخطوات 4.1 - 4.4).

< p class = "jove_title" >4. فحص LDH

ملاحظة: يتم إجراء اختبار LDH في صفيحة مكونة من 96 بئرا مع 100 ميكرولتر من المادة الطافية للثقافة في المجموع بعد فترة ما بعد الحضانة.

1. بعد حضانة PCLS مع أو بدون عوامل الاختبار ، خذ 50 ميكرولتر من المادة الطافية من الخطوة 1.16 وانقلها في نسخ مكررة إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا. هذا يولد نسخا مكررة من كل بئر معالج من صفيحة 24 بئرا.
2. قم بإعداد محلول العمل لكاشف LDH مباشرة قبل الفحص. يتكون محلول العمل من محلول المحفز (التجفيد المذاب في 1 مل من الماء المقطر) ومحلول الصبغة الذي توفره الشركة المصنعة. بالنسبة للوحة واحدة مكونة من 96 بئرا ، امزج جيدا 125 ميكرولتر من محلول المحفز مع 6.25 مل من محلول الصبغة.
   أنذر: لا تعرض المحلول للضوء المباشر.
3. Pipet 50 ميكرولتر من محلول العمل في كل بئر يحتوي بالفعل على 50 ميكرولتر من المادة الطافية واحتضان اللوحة لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. لا يلزم الخلط الإضافي.
4. قم بقياس امتصاص كل بئر عند 492 نانومتر (المرجع: 630 نانومتر) باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. اطرح الامتصاص عند 630 نانومتر من 492 نانومتر. وتستعمل هذه القيم في الحساب في الخطوة 3.5.
   ملاحظه: لا يمكن الحصول على بيانات موثوقة لتقييم السمية الخلوية إلا من الأنسجة القابلة للحياة. يجب أن يكون امتصاص التحكم المعالج بالمنظفات أكثر من 1.
5. للتحليل ، قم بتعيين قيمة امتصاص التحكم الإيجابي من الخطوة 2.1 على أنها 100٪ واحسب إطلاق LDH في العينات المعالجة فيما يتعلق بالتحكم الإيجابي (أي الحد الأقصى لإطلاق LDH).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نونك مايكروويل 96 - بئر Thermo Scientific (Schwerte ، ألمانيا) 260836 برنامج عرض الصور Bitplane AG (زيورخ ، سويسرا) ايماريس 7.6 متصفح الصور LSM زايس (جينا ، ألمانيا) قارئ متعدد الآبار مجموعة تيكان المحدودة (مانيدورف ، سويسرا) تيكان لافينيت F200 برو قارئ اللوحة مجموعة الكشف عن السمية الخلوية (LDH) روش (بازل ، سويسرا) 11644793001 كاشف تكاثر الخلايا WST-1 روش (بازل ، سويسرا) 11644807001 عازلة الغسيل ميرك (دارمشتات ألمانيا) 524653 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني منظف سيجما (سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية) X100-100 مل تريتون X-100