اختبار قائم على التألق باستخدام الخلايا الليمفاوية المصممة هندسيا لفحص المركبات المعدلة للمناعة

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Fouda، A.، et al.، مقايسة الخلايا الليمفاوية القائمة على التألق مناسبة للفحص عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة. J. Vis. Exp. ، (2017).

يوضح هذا الفيديو فحص المركبات المعدلة للمناعة عن طريق الفحص القائم على الفلورسنت. يتم التعامل مع الخلايا الليمفاوية التائية المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا مع أشرطة تعبير البروتين الفلوري الأخضر بهذه المركبات. تتيح إشارات GFP المحسنة والمصغرة تحديد التأثيرات التحفيزية والمثبطة للمركبات ، على التوالي.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. تحضير وسيط خلايا الطحال ومخزن التدفق

الخلوي

1. قم بتنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء بيولوجي منظف بالإيثانول بنسبة 70٪.
2. قم بإزالة 70 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 1x المتوسط المسخن مسبقا (متوفر تجاريا ويتم توفيره في زجاجات معقمة بحجم 500 مل) وضعها في أنبوب معقم. سيتم استخدام الوسيط الذي تمت إزالته لاحقا في البروتوكول.
3. استكمل 430 مل المتبقية من RPMI 1640 1x مع 50 مل من مصل الأبقار الجنينية المعطل (FBS) ، و 5 مل بنسلين / ستربتومايسين ، و 5 مل N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ، و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 5 مل من بيروفات الصوديوم ، و 0.05 مل مصفى (1M) 2-mercaptoethanol.
   ملاحظه: وسط خلايا الطحال الدافئ مسبقا باستخدام حمام مائي على درجة حرارة 37 درجة مئوية لتجنب الخلايا التي تصدم بالحرارة. هذا مهم لتجنب تحريض موت الخلايا المبرمج الخلوي.
4. لتحضير المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، أضف 2 مل من FBS إلى 98 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واحتفظ به في الثلاجة حتى الاستخدام (يفضل في غضون ثلاثة أيام).

فئة

2. توليد معلق خلايا الطحال من طحال الفأر Nur77^GFP

1. عزل الطحال بشكل معقيم عن أنثى فأر Nur77^GFP يبلغ من العمر 6-8 أسابيع.
   1. لتحقيق ذلك ، اعمل تحت غطاء معقم. انقع فرو الفأر المضحى به والمقص والملقط في 70٪ من الإيثانول.
   2. ضع الفأر على جانبه الأيمن ، وقم بقص الجلد والعضلات في الربع العلوي الأيسر من البطن. افحص منطقة الشق لتحديد موقع الطحال بشكل واضح ثم اقطعه. احتفظ بالطحال في وسط خلايا الطحال على الجليد حتى يصبح جاهزا لتنفيذ الخطوة التالية.
2. ضع الطحال (الطحال) في طبق بتري مزرعة خلية مقاس 10 سم² يحتوي على 5 مل من وسط خلايا الطحال الدافئ مسبقا.
3. اهرسي الطحال باستخدام مكبس حقنة معقمة حتى يصبح المحلول عكرا. يجب أن تبقى مصفوفة الكولاجين في الطحال بنهاية الإجراء.
4. بعد الهرس المكثف في وسط خلايا الطحال ، اجمع معلق الخلية وقم بتمريره عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب سعة 50 مل لتصفية أي حطام أو جلطات.
5. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 2-3 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء المنتجة أو التجارية في المنزل. بعد سحب العينات (2-3 مرات) اترك التعليق يرتاح لمدة 20-30 ثانية.
6. أضف 5 مل من PBS أو مخزن مؤقت مناسب من اختيارك ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
7. قم بإزالة المادة الطافية (يجب أن تكون حمراء اللون لأنها تحتوي على خلايا الدم الحمراء المحللة) وأعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط خلايا الطحال.
8. باستخدام مقياس كثافة الدم ، احسب عدد الخلايا الملطخة باللون الأزرق للتمييز بين الخلايا الحية والميتة (النخرية).

فئة

3. عزل الخلايا التائية من تعليق خلايا الطحال

1. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 500 × جم. أعد تعليق الخلايا في وسط RPMI خال من المصل (50 مل من الخطوة 1.3) للحصول على تركيز خلوي 10 × 10⁶ خلايا / مل.
2. انقل الخلايا إلى أنبوب بوليسترين سعة 5 مل واترك جانبا 100 ميكرولتر من خلايا الطحال لتقييم / مقارنة النقاء في نهاية خطوة التنقية.
3. أضف مصل الفئران العادي إلى معلق الخلية عند 50 ميكرولتر / مل متبوعا بمزيج من الأجسام المضادة لعزل الخلايا التائية (50 ميكرولتر / مل).
4. اخلطي معلق الخلية واتركيه يرتاح لمدة 10 دقائق. تسمح هذه الخطوة لكوكتيل الأجسام المضادة بربط جميع الخلايا غير المرغوب فيها.
5. أضف الكرات السريعة الستربتافيدين (الخرز المغناطيسي) لمدة 2.5 دقيقة ، ثم ارفع الحجم إلى 2.5 مل باستخدام الوسط الخالي من المصل.
6. ضع الأنبوب في مغناطيس عزل الخلية لمدة 3 دقائق.
7. انقل تعليق الخلية التائية إلى أنبوب بوليسترين جديد عن طريق إمساك المغناطيس وسكب المحلول في حركة واحدة.
   ملاحظه: يحتوي المعلق المعزول على الخلايا التائية المنقاة. يتم الاحتفاظ بجميع الخلايا غير المرغوب فيها على جانب الأنبوب المرتبط بخرز الستربتافيدين المغناطيسي.
8. عد الخلايا التائية المعزولة باستخدام تريبان الأزرق ومقياس الدم.
   ملاحظه: في هذه الخطوة ، يمكن التحقق من نقاء الخلايا التائية المعزولة (اختياري) عن طريق تحليل النسبة المئوية لأحداث CD3 ⁺ قبل وبعد عزل الخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي.
   1. باختصار ، جهاز طرد مركزي 1 مل من تعليق خلايا الطحال عند 500 × جم. تخلص من المادة الطافية الخلايا في مخزن مؤقت لقياس التدفق الخلوي بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / مل.
   2. أضف الجسم المضاد CD3 المضاد للفأر الموسوم بالفلورسنت بتركيز 1: 100. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل مرة واحدة ، وجهاز الطرد المركزي ، وأعد تعليقه في المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي (400 ميكرولتر) للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

< p class = "jove_title" >4. تنشيط الخلايا التائية وتحريض تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP)

1. قم بزرع الخلايا التائية ، في حالة تعليق ، في صفيحة مستديرة القاع 96 بئرا بتركيز 2.5 × 10⁵ خلايا / بئر.
2. أضف الإنترلوكين المؤتلف (IL) -7 عند 2 نانوغرام / مل والخرز المغناطيسي CD3 / CD28 (25 ميكرولتر / 10⁶ خلايا). احتفظ بجزء من الخلايا التائية غير معالج بالخرز لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي للقياسات اللاحقة التي تمثل الخلايا التائية غير المنشطة.
3. بعد اثنتي عشرة ساعة ، قم بحصاد الخلايا التائية من الصفيحة المكونة من 96 بئرا عن طريق سحب تعليق الخلية برفق في كل بئر لأعلى ولأسفل لكسر أي مركب / مجاميع لخلايا الخرز. اجمع المعلق من جميع الآبار في أنبوب بوليسترين سعة 5 مل.
4. ضع الأنبوب الذي يحتوي على التعليق داخل نفس مغناطيس عزل الخلية المستخدم سابقا لتنقية الخلايا التائية واتركه يرتاح لمدة 5 دقائق.
5. انقل تعليق الخلية التائية إلى أنبوب بوليسترين جديد عن طريق الإمساك بالمغناطيس وسكب المحلول بحركة واحدة.
6. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في وسط خلايا الطحال الطازجة للحصول على تركيز 2 × 10⁶ خلايا / مل.
7. تقييم شدة تعبير GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي (اختياري لمراقبة الجودة) بعد 12 إلى 24 ساعة من التحفيز مقارنة بالخلايا التائية غير المنشطة. ¹²< / > ملاحظه: يعتبر تألق GFP متأصلا في الخلايا التائية Nur77^GFP ويتجلى عند التنشيط الناجح لمستقبل الخلايا التائية ، TCR.
8. لتقييم الجدوى والتنشيط (اختياري) عن طريق الفحص المجهري ، قم بتلطيخ الخلايا المنشطة باستخدام Hoechst قبل 30 دقيقة من التحليل بتركيز 0.2 ميكروغرام / مل. أضف حجما مناسبا من تعليق الخلية إلى شريحة غطاء أو بئر من صفيحة مسطحة ذات جوانب سوداء 384 بئرا وفحصها تحت المجهر الفلوري لتقييم الخلايا الحية. لن تحتفظ الخلايا الميتة بالتلوين النووي.

< p class = "jove_title" >5. فحص الإنتاجية العالية (HTS) للجزيئات الصغيرة

1. قم بإعداد معلق خلوي عند 2 × 10⁶ خلايا / مل من الخلايا التائية المنشطة (الخرز المغناطيسي أو الأجسام المضادة / CD40L) أو المجموعات غير المنشطة.
2. صفيحة 75,000 خلية / بئر في صفيحة 384 بئر (حجم 40 ميكرولتر). استخدم صفيحة مسطحة ذات جوانب سوداء 384 بئرا أو شريحة غطاء مجهر لتقييم الجدوى والتنشيط بواسطة الفحص المجهري الفلوري (خطوة مراقبة الجودة الاختيارية قبل HTS) باستخدام صبغة Hoechst (راجع الخطوات 4.8 للحصول على التفاصيل).
3. يدويا أو باستخدام نظام آلي ، أضف الأدوية المفضلة (المذابة في 0.5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO) إلى كل بئر.
4. أضف السيارة (DMSO) إلى آبار التحكم الموجبة (المنشطة) والسالبة (غير المنشطة). اضبط تركيز DMSO بحد أقصى 0.5٪.
5. احتضان الألواح لمدة 24 ساعة (أو وقت الحضانة الذي تختاره) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ثاني أكسيد الكربون₂.
6. في يوم الفحص ، قم بتخفيف محلول البقع Hoechst 33342 (1: 3،333 ؛ على سبيل المثال ، أضف 10 ميكرولتر إلى الخلايا الموجودة في الألواح المكونة من 384 بئرا لتوليد حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر). قم بصبغة اللون قبل 30 دقيقة من تحليل GFP عن طريق إضافة محلول Hoechst لتحقيق تركيز 0.2 ميكروغرام / مل.
7. قم بتحريك الخلايا برفق لأعلى ولأسفل للحصول على توزيع متجانس في كل بئر.
   ملاحظه: هذه الخطوة مهمة في حالة صرف الأدوية (الخطوة 5.3) باستخدام نظام آلي حيث تميل الخلايا إلى التراكم على جانب واحد من البئر ، عكس اتجاه التدفق.
8. قم بتدوير الألواح على 45 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
9. اترك الأطباق لترتاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
10. قم بإجراء قراءات اللوحة (الألواح) باستخدام نظام الفحص الآلي للمحتوى العالي متحد البؤر (HCS). قم بتحميل اللوحة على الجهاز. اضبط الهدف على تكبير 40X أو أعلى. استخدم الكاميرا # 4 ل Hoechst (مصباح الأشعة فوق البنفسجية) والكاميرا # 1 ل GFP (الليزر 488). قم بإعداد الجهاز لقراءة 6-10 حقول لكل بئر. اضبط الجهاز لإجراء قراءتين متتابعتين لكل حقل عند 488 نانومتر (لقراءة GFP) وضوء الأشعة فوق البنفسجية (لقراءة Hoechst). اضبط الهدف على تكبير 40X أو أعلى.
    ملاحظه: النظام عبارة عن مجهر محوسب لا يتطلب أي تعديلات. يتم إعداد المسافة البؤرية وشدة الضوء الساقط ووقت التعرض تلقائيا بواسطة الجهاز.

Materials