$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< p class = "jove_title" >
1. إعداد الأداة
ملاحظة: يتطلب تصوير الخلايا المرتفعة مغناطيسين من النيوديميوم الأرضي النادر الممغنطين على المحور z ليتم وضعهما مع مواجهة نفس القطب لبعضهما البعض لتوليد مجال مغناطيسي. يمكن تخصيص المسافة بين المغناطيس اعتمادا على شدة المجال المغناطيسي وكثافة الأهداف. في هذه الحالة ، يتم فصل المغناطيس بمساحة 1 مم كافية لإدخال أنبوب شعري زجاجي مربع بطول 50 مم 1 × 1 مم. تمت طباعة الجهاز ثلاثي الأبعاد باستخدام تصميم AutoCAD ، وهو متاح عند الطلب.
- ضع المجهر على جانبه ، أفقيا تماما.
ملاحظه: المجهر الموجود في وضع عمودي قياسي غير مناسب بشكل مباشر لتصوير الأجسام المرتفعة بسبب مواضع المغناطيس فيما يتعلق بالمكثف والهدف. يمكن تجاوز هذا القيد عن طريق وضع المجهر على جانبه ، أفقيا تماما ، مما يسمح للمكثف بتركيز الضوء في الشعيرات الدموية ، والعدسة الموضوعية لتصوير الخلية وهي تحلق بين المغناطيس ، مع الحفاظ على متطلبات إضاءة Köhler.
- ادعم الحامل وقم بتسويته على طاولة اللوح باستخدام 2 أو 3 مقابس مختبر.
- للحد من الاهتزازات ، ادعم طاولة اللوح بأقدام مبللة بالمطاط.
- قم بإزالة المسرح واستبدله بمقبس مختبر مضغوط لضبط ارتفاع جهاز الرفع (المحور y) ، ومرحلتين انتقاليتين أحادية المحور ؛ واحدة لضبط التركيز (المحور z) ، والثانية لمسح الأنبوب الشعري.
- قم بتوصيل جهاز الرفع المغناطيسي بمقبس المختبر باستخدام عمودين بصريين من سلسلة صغيرة.
< p class = "jove_title" >
2. ارتباط الجسم المضاد بالجسيمات / الخرز الكربوكسي الدقيق (تم تعديله من بروتوكول بواسطة PolyAn)
ملاحظة: يجب طلاء الخرز منخفض الكثافة فقط (1.05 جم / مل) للكشف عن الريسوس ، Rh (+) ، ولكن يتم طلاء كل من الخرزات عالية الكثافة ومنخفضة الكثافة للكشف عن الحويصلات خارج الخلية.
- أخرج ما يعادل 1 مجم من معلق الخرزة وأضفه إلى 0.5 مل من عازلة التنشيط (50 ملي مولار 2- (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيك ، MES (MW195.2 ، 9.72 مجم في 1 مل)) درجة الحموضة 5.0 و 0.001٪ بولي سوربات -20).
- أضف 12 ميكرولتر من 1.5 م 1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد هيدروكلوريد (EDC) الطازج (MW 191.7 ، 0.28755 جم في 1 مل) و 12 ميكرولتر من 0.3 M Sulfo-N-Hydroxysuccinimide (NHS) (MW 217.14 ، 0.0651 جم في 1 مل) في ماء مثلج.
- ضع الأنابيب على شاكر مداري ورجه بقوة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتنشيط مجموعات الكربوكسيل على الخرز.
- أوقف التنشيط بعد 1 ساعة عن طريق إضافة 0.5 مل من Coupling Buffer (10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، PBS ، أو 0.1 M من الفوسفات ، 7-9).
- قم بتكسير الخرزات عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 10 دقائق ، أو إذا تعذر تكوير الخرزات ، فاستخدم مرشح أنبوب الطرد المركزي 0.45 ميكرومتر. استنشق المادة الطافية أو التدفق.
- اغسل الخرزات ب 1 مل من 10x PBS 3 مرات كما في الخطوة 2.5.
- احسب 25 ميكروغرام من الجسم المضاد لكل حبات ملغ واخلط الجسم المضاد المطلوب مع الخرز المنشط إلى تركيز الأجسام المضادة النهائي 0.7-1.0 مجم / مل في 10X PBS.
- ضع الأنابيب على أنبوب هزاز على سرعة منخفضة. لف الأنابيب برفق في درجة حرارة الغرفة طوال الليل للتوصيل.
- كرر الخطوة 2.5 واغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 مل من 10x PBS.
- يغسل ب 0.5 مل من 1 M ethanolamine (98٪ مخزون = 16.2 م) في درجة الحموضة العازلة 8.0 مع 0.02٪ Polysorbate-20 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع رجها برفق.
- كرر الخطوة 2.5 واغسل الخرزات مرة واحدة في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco. يمكن تخزين الخرزات في 200 ميكرولتر من DPBS عند 4 درجات مئوية لحين الحاجة. < / >
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
فئة
3. جمع وتحضير الدم للكشف عن Rh (+)
- باستخدام جهاز وخز بنقرة واحدة ، وخز إصبع متبرع ب Rh (+) واجمع 10 ميكرولتر من الدم في 1 مل من DPBS.
- تلطخ خلايا Rh + ببقعة غشاء البلازما الفلورية. اختياريا ، أضف 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت إلى معلق 1 مل لخلايا Rh + (تخفيف 1: 1000).
- احتضان الخلايا بصبغة الفلورسنت عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- قم بتكسير الخلايا عن طريق الدوران عند 5,600 × جم لمدة 15 ثانية واغسلها 3 مرات باستخدام 1 مل من DPBS. أعد تعليقه في 1 مل من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS ++).
- باستخدام جهاز الوخز بنقرة واحدة ، وخز إصبع متبرع ب Rh (-) واجمع 2 ميكرولتر من الدم.
ملاحظه: في حالة التحضير لأكثر من حالتين ، اجمع ما يكفي من الدم لإضافة 1 ميكرولتر من الدم Rh (-) إلى كل أنبوب.
- تحضير الأنابيب التجريبية اللازمة: الخرز وحده ، التحكم في الغلوبولين المناعي G (IgG) ، العينة.
- الخرزات وحدها: أضف 174 ميكرولتر من HBSS ++ ، و 1 ميكرولتر من حبات التحكم IgG ، و 1 ميكرولتر من الخرز عالي الكثافة (1.2 جم / مل) ، و 24 ميكرولتر من 500 ملي مولار Gd3+ (60 مل).
- التحكم في IgG: أضف 172 ميكرولتر من HBSS ++ ، و 1 ميكرولتر من حبات التحكم IgG ، و 1 ميكرولتر من الخرز عالي الكثافة ، و 1 ميكرولتر من الدم Rh + الملون ، و 24 ميكرولتر من 500 ملي Gd3+.
- يضيف أنبوب العينة 172 ميكرولتر من HBSS ++ ، و 1 ميكرولتر من الخرز المطلي بمضاد ل RhD ، و 1 ميكرولتر من الخرز عالي الكثافة ، و 1 ميكرولتر من الدم Rh ، و 1 ميكرولتر من معلق الدم الملون Rh (+) ، و 24 ميكرولتر من 500 ملي مولار 3+ .
ملاحظه: تضاف حبات عالية الكثافة إلى عينات Rh كمرجع.
< p class = "jove_title" >
4. تحليل الخلايا على جهاز الرفع المغناطيسي
- قم ببدء تشغيل الأداة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قم بتحميل 50 ميكرولتر من العينة في أنبوب شعري حتى يتم ملء الأنبوب. أغلق نهايات الأنبوب الشعري بمادة مانعة للتسرب شعرية مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
- قم بتحميل الأنبوب الشعري في الحامل بين المغناطيس العلوي والسفلي. اضبط المرحلة والتركيز للحصول على عرض مثالي.
ملاحظه: يمكن أن تستغرق الخلايا / الخرزات في أي مكان من 5-20 دقيقة للوصول إلى موضع التوازن المغناطيسي بناء على كثافتها وتركيز Gd3+. كلما زاد تركيز Gd3+ ، كان الوقت أقصر.