مقالة منهجية

تأثير عامل دوائي معدل مناعي على التفاعل بين الخلايا المتغصنة والخلايا التائية CD4 +

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Wei, H., et al. التطوير والتوصيف الوظيفي للخلايا المتغصنة ذات التوتر العضلي في الفئران. J. Vis. Exp. (135) ، (2018).

يوضح هذا الفيديو طريقة لتحويل الخلايا المتغصنة (DCs) إلى DCs تحمل المنشأ (TolDCs) باستخدام عامل دوائي معدل المناعة. يتم تأكيد هذا التحويل من خلال تقييم وظيفة TolDC من خلال تأثيرها المثبط للمناعة على خلايا CD4 + T.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تقييم وظيفة TolDCs في المختبر وفي الجسم الحي

  1. مقايسة الانتشار التركيبي للخلايا التائية
    1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم وإجراء التجربة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية مع إجراءات السلامة المناسبة.
    2. قم بإعداد مخزن MACS المؤقت باستخدام 0.5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 2 ملي مولار EDTA في 500 مل PBS. قم بتعقيم المخزن المؤقت عن طريق التصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
      ملاحظه: احتفظ بالمخزن المؤقت على الجليد أثناء التجربة التالية.
    3. للحصول على خلايا CD4 + T ، قم بالقتل الرحيم للفئران المعدلة وراثيا لمستقبلات الخلايا التائية OT-II (TCR) التي يبلغ عمرها من 8 إلى 10 أسابيع باستخدام غرفة CO2. ضع الماوس على لوح تشريح واشطفه بنسبة 70٪ من الإيثانول. عزل الطحال عن الجانب الأيسر من البطن باستخدام المقص الجراحي والملقط.
    4. ضع الطحال مع 2 مل PBS في طبق مزرعة 6 سم واستخدم الجزء الخلفي من عصا الدفع لحقنة 3 مل لفرم الطحال عن طريق تمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
    5. اجمع تعليق الخلية وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs.
    7. أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين CD4 + T Cell عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق
      ملاحظه: يرتبط كوكتيل الأجسام المضادة بأنواع الخلايا الأخرى باستثناء خلايا CD4 + T ، مثل CD8a و CD11b و CD11c و CD19 و CD25 و CD45R (B220) و CD49b (DX5) و CD105 و Anti-MHC class II و Ter-119 و TCRγ / δ.
    8. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS و 200 ميكرولتر من الخرز المضاد للبيوتين (جدول المواد) عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    9. ضع العمود المكون من الكرات المغناطيسية الحديدية (جدول المواد) ومرشح الفصل المسبق معا في المجال المغناطيسي واشطفه ب 3 مل من المخزن المؤقت MACS.
    10. أضف 9 مل من المخزن المؤقت MACS في الخلايا وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    11. أعد تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت MACS وقم بتطبيقه على العمود. جمع التدفق الذي يحتوي على خلايا CD4 + T.
    12. اغسل العمود ب 3 مل أخرى من المخزن المؤقت MACS واجمع أيضا التدفق.
    13. للحصول على عموم الطحال DCs ، قم بالقتل الرحيم للفئران C57BL / 6 التي تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع باستخدام غرفة ثاني أكسيد الكربون2. ضع الماوس على لوح تشريح واشطفه بنسبة 70٪ من الإيثانول. عزل الطحال عن الجانب الأيسر من البطن باستخدام المقص الجراحي والملقط. ضعي الطحال في طبق استزراع 6 سم يحتوي على 2 مل من محلول الكولاجيناز D (2 مجم / مل كولاجيناز D مذاب في HBSS يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم).
    14. حقن 1 مل من محلول الكولاجيناز D في الطحال مرتين باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 25 جرام. قطع الطحال إلى قطع صغيرة بمقص صغير.
    15. يرج ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
    16. أضف 500 ميكرولتر من 0.5 م EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق < / > ملاحظه: والخطوات من 1-1-13 إلى 1-1-14 حاسمة لزيادة غلة البلدان النامية.
    17. استخدم الآن الجزء الخلفي من عصا الضغط للحقنة سعة 3 مل لفرم ملاط الطحال عن طريق تمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع تعليق الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    18. أعد تعليق حبيبات الخلية في 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS ، و 50 ميكرولتر من كاشف حجب FcR ، و 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين للخلايا المتغصنة عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق><. ملاحظه: كوكتيل الأجسام المضادة ضد المستضدات التي لا يتم التعبير عنها بواسطة DCs.
    19. اغسل الخلايا بإضافة 9 مل من عازلة MACS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    20. أعد تعليق حبيبات الخلية في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS وأضف 200 ميكرولتر من الخرز المضاد للبيوتين عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    21. كرر الخطوات من 1.1.9-1.1.11 لتجميع DCs.
    22. اغسل العمود ب 3 مل أخرى من المخزن المؤقت MACS مرتين واجمع أيضا التدفق.
    23. عالج 2 × 105 DC / مل في وجود أو عدم وجود 100-400 نانومتر CDDO-DFPA عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بشكل منفصل ، قم بتسمية خلايا CD4 + T (1 × 107 / مل) ب 1 ميكرومتر CFSE عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، واغسلها باستخدام PBS ، وأعد ضبط مستوى الصوت للحصول على التركيز النهائي عند 2 × 106 خلايا T / مل.
    24. بعد ذلك ، في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، قم بالزراعة المشتركة 100 ميكرولتر من الخلايا المتغصنة المعالجة بنفس الحجم من خلايا CD4 + T المسماة CFSE ، وكلاهما تم جمعه من الخطوات المذكورة أعلاه للحصول على نسبة 1:10. أضف الآن 100 نانوغرام / مل من ببتيد البيضافات (OVA) 323-329 لكل بئر وقم بقياس شدة CFSE للخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد 2-3 أيام من الحضانة.
      ملاحظه: تم تحسين أرقام الخلايا ونسبة الخلايا التيار المستمر والخلايا التائية من عملنا السابق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات CDDO-DFPA (RTA-408) رياتا للمستحضرات الصيدلانية في التوليف المنزلي زراعة الخلايا الماوس GM-CSF شركة Peprotech 315-03 تمايز BMDC طقم عزل الخلايا المتغصنة شركة ميلتيني بيوتيك 130-100-875 مقايسة تكاثر الخلايا التائية عموم الخلية الشجيرية البيوتين والأجسام المضادة كوكتيل شركة ميلتيني بيوتيك 130-100-875 مقايسة تكاثر الخلايا التائية طقم عزل الخلايا التائية CD4 + شركة ميلتيني بيوتيك 130-104-454 مقايسة تكاثر الخلايا التائية CFSE بيو ليجند 423801 مقايسة تكاثر الخلايا التائية كاشف حجب FcR شركة ميلتيني بيوتيك 130-100-875 مقايسة تكاثر الخلايا التائية الميكروبيدات المضادة للبيوتين شركة ميلتيني بيوتيك 130-104-454 مقايسة تكاثر الخلايا التائية حقنة 1 مل BD Biosciences 309626 مقايسة تكاثر الخلايا التائية جيش صرب البوسنه شركة سيجما ألدريتش أ 2058 مقايسة تكاثر الخلايا التائية EDTA ثيرموفيشر العلمي 15575020 مقايسة تكاثر الخلايا التائية عمود LS شركة ميلتيني بيوتيك 130-042-401 مقايسة تكاثر الخلايا التائية مرشح ما قبل الفصل شركة ميلتيني بيوتيك 130-095-823 مقايسة تكاثر الخلايا التائية كولاجيناز د شركة سيجما ألدريتش 11088858001 مقايسة تكاثر الخلايا التائية HBSS ثيرموفيشر العلمي 14025076 مقايسة تكاثر الخلايا التائية ببتيد البيضا (OVA) 323-329 شركة سيجما ألدريتش [أو1641] مقايسة تكاثر الخلايا التائية

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CFSE

مقالات ذات صلة