تقنية في المختبر لتصور إفراز الخلايا الإفرازية في الخلايا البدينة

الملخص

المصدر: Klein ، O. ، et al. تصوير FITC-dextern كمراسل لإفراز الخلايا المنظم J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لتصور إفراز الخلايا البدينة. يتم تحضين الخلايا باستخدام FITC-dextran - مراسل الفلورسنت - الذي تمتصه الخلايا داخل الحبيبات الإفرازية (SGs) ، حيث يروي الرقم الهيدروجيني الحمضي تألقه. عند تحفيز إفراز الخلايا الحبيبية ، يؤدي ارتفاع درجة الحموضة في الوسط إلى تألق المراسل داخل SGs المنصهرة ، والتي يتم تصورها باستخدام مجهر فلوري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

1. تحضير وسائط زراعة RBL (خط الخلايا البدينة RBL-2H3)
   1. امزج 500 مل من متوسط النسر المعدل منخفض الجلوكوز (DMEM) من دولبيكو مع 56 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 5.5 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين والنيستاتين ، و 5.5 مل من محلول L-Glutamine 200 مل. ينتج عن هذا انخفاض الجلوكوز DMEM المكمل بنسبة 10٪ FBS و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين و 100 وحدة / مل بنسلين و 12 وحدة / مل نيستاتين و 2 ملي مولار من الجلوتامين.
   2. قم بتصفية الوسائط باستخدام مرشح فراغ علوي بحجم مسام 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
2. صيانة خلايا RBL.
   1. تنمو خلايا RBL إلى حد أقصى 90٪ في طبق 10 سم. إذا كانت مزرعة الخلية صحية ، فيجب أن يكون للخلايا شكل مغزل مع نتوءات عرضية.
   2. لتقسيم الخلايا ، افصل الخلايا عن الطبق عن طريق شفط الوسائط واستبدالها ب 2 مل من محلول التربسين / EDTA B. احتضن لمدة 5-10 دقائق في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} عند 37 درجة مئوية.
   3. بمجرد انفصال الخلايا ، قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 2 مل من وسائط الثقافة ، باستخدام ماصة ، وتقسيم الخلايا بنسبة 1: 2 - 1: 10.
3. تحضير 20x المخزن المؤقت Tyrode
   1. قم بإعداد محلول مخزون 20x من 54 ملي مولار كلوريد كلوريد ، 20 ملي مولار كلوريد_{الصوديوم 2} ، و 2.74 ملي كلوريد الصوديوم ، و 8 ملي مولار من هيدروجين_{هيدروكسيد 2}PO₄ في الماء المقطر المزدوج (DDW). تخلط جيدا وتخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. ثقافة خلايا RBL للفحص المجهري للخلايا الحية

1. تحضير محلول FITC-dextran.
   1. اخلطي 1 ملغ من مسحوق الفلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) -ديكستران (150 كلفن) لكل 1 مل من وسائط الاستزراع (انظر الخطوة 1.1.1). للحصول على غطاء زجاجي كامل الغرف ، قم بإعداد 3 مل.
   2. باستخدام وحدة تصفية حقنة أسيتات السليلوز بحجم مسام 0.22 ميكرومتر ، قم بتصفية FITC-dextran المذاب.
   3. أضف الغلوبولين المناعي E للفأر (IgE) إلى تركيز 1 ميكروغرام / مل.
2. بذر خلايا RBL للتصوير
   1. في اليوم السابق للتصوير ، قم بشفط الوسائط من طبق الاستزراع واستبدلها ب 2 مل من محلول التربسين / حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ب. احتضان لمدة 5 - 10 دقائق في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية. بمجرد انفصال الخلايا ، قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 2 مل من وسائط الاستزراع.
   2. عد خلايا RBL باستخدام مقياس كثافة الدم واضبط الحجم وفقا لذلك باستخدام وسائط الثقافة للحصول على تركيز خلية 7.5 × 10⁵ / مل.
   3. أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى غطاء زجاجي مملوء مسبقا بوسائط استزراع جديدة مكملة ب FITC-dextern (ينتج عن هذا بذر 7.5 × 10³ خلايا في الغرفة).
   4. تنمو خلايا RBL بين عشية وضحاها في جو رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية. يجب أن تظل الخلايا على مستوى التقاء فرعي للتأكد من فصل الخلايا وأنه من السهل التعرف على كل خلية على حدة تحت المجهر.
3. تعداء خلايا RBL - اختياري.
   1. لتصوير الأحداث الخارجية بالاشتراك مع البروتينات الأخرى ذات العلامات الفلورية ، انظر بروتوكول التعدي لخلايا RBL في Azouz et al.

3. الفحص المجهري للخلايا الحية لإفراز

الخلايا

1. تحضير الحلول:
   1. قم بإعداد محلول عازل نهائي من Tyrode عن طريق تخفيف محلول المخزون في DDW في تخفيف 1:20 ومكملات ب 20 ملي مولار من Hepes pH 7 و 1.8 ملي CaCl₂ و 1 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 5.6 ملي مولار جلوكوز.
   2. قم بإعداد كاشف إفرازي 20x في مخزن Tyrode المؤقت [1 ميكروغرام / مل ثنائي نيتروفينيل مترافق مع ألبومين المصل البشري (DNP-HAS (Ag)) في حالتنا ، بتركيز 50 نانوغرام / مل 1x].
   3. قم بإعداد محلول كلوريد الأمونيوم 400 ملي مولار عن طريق إذابة المسحوق في عازلة Tyrode.
2. تحضير الخلايا.
   1. اغسل الغطاء الزجاجي الموجود في الغرفة 3 مرات عن طريق شفط الوسائط من الغرفة وإعادة تعبئتها ب 300 ميكرولتر من عازلة Tyrode ، الدافئة مسبقا إلى 37 درجة مئوية. أخيرا ، قم بتجديد الغرفة ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتيرود ، الدافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
   2. ضع غطاء الغطاء الزجاجي في غرفة حاضنة المجهر. تأكد من أن الغرفة مستقرة.
3. إعداد المجهر
   1. لاختيار منطقة ذات أهمية لتتبعها ، قم بتشغيل مصدر ضوء الفلورسنت (مصباح الزئبق تقليديا) واختر مرشح التألق المناسب (اختر مرشح الفلوروفورات الخضراء لعرض FITC-dextran). بمجرد أن تصبح منطقة الاهتمام في بؤرة التركيز وتكون في منتصف مجال الرؤية ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء لتجنب التبييض الضوئي والسمية.
      ملاحظة: قد تحتفظ بعض FITC-dextran المدمجة في الخلايا بالتألق. وذلك لأن FITC-dextern يمكن أيضا فرز في مقصورات غير ليزوزومية مثل الجسيمات الداخلية.
   2. قم بتشغيل الإضاءة المناسبة لإثارة FITC. إذا كنت تستخدم مجهرا قائما على الليزر، فقم بتشغيل الليزر 488 نانومتر. يجب تجميع الانبعاثات حوالي 500 - 550 نانومتر (ذروة انبعاثات FITC عند 510 - 520 نانومتر).
   3. عند استخدام المجهر متحد البؤر ، افتح الثقب إلى أقصى حد. سيسمح ذلك باستخدام طاقة ليزر أقل لتجنب التبييض والسمية وسيضمن التقاط أحداث إفراز الخلايا من جميع مستويات الخلية.
   4. معايرة الفاصل الزمني بين عمليات الحصول على الصور.
      1. قد تختلف الخلايا المختلفة في حركية إفراز الخلايا المنظمة. لتصوير محدد لإفراز الخلايا المركب ، نوصي بفاصل زمني لا يقل عن 5 ثوان. ومع ذلك ، كقاعدة عامة ، للسماح بالتصوير السريع ، تأكد من أن وقت اكتساب إطار واحد سريع.
      2. عند استخدام مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر ، اضبط اتجاه المسح على ثنائي الاتجاه ، ولا تسمح بالمتوسط ، واضبط الدقة على 512 × 512 (موصى به ؛ سيساعد الحكمان الأخيران أيضا على تقليل التبييض والسمية).
4. تصوير إفراز اليدوية.
   1. خلايا الصورة لفترات الفترات المطلوبة، اعتمادا على نوع الخلية أو الإفراز. في خلايا RBL التي يتم تشغيلها باستخدام IgE / Ag ، تحدث معظم الأحداث الغريبة في غضون 15-20 دقيقة من التنشيط.
   2. لتنشيط الخلايا ، أضف 16 ميكرولتر من محلول إفرازات 20x إلى الغرفة.
5. تأكيد وجود FITC-dextran في الخلايا.
   1. لتأكيد وجود وتوطين FITC-dextran إلى SGs ، أضف 16 ميكرولتر من محلول كلوريد الأمونيوم (احرص على عدم تحريك الغرفة حتى لا تفقد التركيز) إلى الغرفة برفق (سيؤدي ذلك إلى التركيز النهائي 20 مليمتر). سيؤدي ذلك إلى تحفيز قلوية SGs وتخفيف مضان FITC ، والذي سيحدث في غضون ثوان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM منخفض الجلوكوز المحفزات البيولوجية 01-050-1 أ مصل الأبقار الجنينية جيبكو هاتف 12657 حل Pen-strep-nystatin المحفزات البيولوجية 03-032-1 ب محلول L-Glutamine 200 ملي المحفزات البيولوجية 03-020-1 أ فيتك ديكستران 150 كيلو سيجما ألدريتش 46946-500 ملغ إف محلول التربسين / EDTA ب المحفزات البيولوجية 03-052-1 أ يسخن في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل الاستخدام مرشح الفراغ العلوي بحجم المسام 0.22 ميكرومتر سيجما ألدريتش CLS430769-1EA وحدة تصفية حقنة أسيتات السليلوز ، حجم المسام 0.22 ميكرومتر سارتوريوس 16534 ك غطاء زجاجي محاط حراري علمي 155411 أطباق الثقافة المعالجة بزراعة الأنسجة سيجما ألدريتش CLS430167 ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش أ 4503 مكافحة DNP أحادية النسيلة IgE سيجما ألدريتش د8406 DNP-HSA (Ag) سيجما ألدريتش أ 6661 تجنب التعرض المباشر للضوء عازلة Hepes 1M ، درجة الحموضة 7.4 المحفزات البيولوجية 03-025-1 ب كلوريد_{الهواء 2} ميرك 102382 الجلوكوز مختبرات BDH 284515 فولت كلوريد الأمونيوم ميرك 1145 م أنابيب ملح ثنائي البوتاسيوم سيجما ألدريتش هاتف: 108321-27-3 هيدرات أسيتات الكالسيوم سيجما ألدريتش هاتف: 114460-21-8 أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدرات سيجما ألدريتش م 5661 غلوتامات البوتاسيوم (حمض الجلوتاميك ، ملح البوتاسيوم أحادي الهيدرات) سيجما ألدريتش جي 1501 NaH₂PO₄ ميرك 6346 م كلوريد الصوديوم ميرك 106404 مغنكلوريد₂ ميرك 105833 كيه سي إل ميرك 104936 المثقاب الكهربائي بي تي إكس نظام التوافق الإلكتروني 830 مجهر متحد البؤر ، زايس زييس LSM 5 باسكال ، أكسيفرت 200 م تستخدم في الشكل 3. مجهزة بجهاز إلكتروني يتم التحكم في درجة حرارته حاضنة تيار الهواء مجهر متحد البؤر ، زايس زييس LSM 800 ، Axio Observer.Z1 /7 تستخدم في الشكل 2. مزود بكاشف GaAsP ، وهو إلكتروني يتم التحكم في درجة حرارته حاضنة تيار الهواء المجهر متحد البؤر ، لايكا لايكا SP5 تستخدم في الشكل 1. مجهزة بكاشف Leica HyD وحاضنة المرحلة العليا (okolab) خلايا RBL-2H3 تم استنساخ خلايا RBL-2H3 في مختبر روبن ب. سيراغانيان. انظر المرجع 67