مراقبة تنشيط الخلايا البائية باستخدام الجسيمات الشحمية المستضدية باستخدام مقايسة تدفق الكالسيوم

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Bednar ، K. J. et al. ، الجسيمات الشحمية المستضدية لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالأمراض.J. Vis. Exp.(2018)

يعرض هذا الفيديو تقييم تنشيط الخلايا البائية من خلال استخدام الجسيمات الشحمية المستضدية. يتم تمييز الخلايا البائية المعالجة بصبغة Indo-1 الحساسة للكالسيوم باستخدام قياس التدفق الخلوي ، ويتم تحليل نسبة التألق البنفسجي إلى الأزرق. عندما تواجه الخلايا الجسيمات الشحمية المستضدية ، فإنها تؤدي إلى تنشيط الخلايا البائية من خلال تدفق الكالسيوم ، مما يعزز تدريجيا نسبة إشارة التألق البنفسجي إلى الأزرق بمرور الوقت.

البروتوكول

فئة

1. اقتران مستضد البروتين مع الدهون PEGylated

1. أضف 3 جم من حبات جل ديكستران المتشابكة بنطاق تجزئة يتراوح بين 1,500-30,000 دالتون (Da) إلى قارورة مفرغة سعة 250 مل. أضف 60 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) وحركه باستمرار باستخدام قضيب تقليب مغناطيسي. أغلق القارورة وقم بتوصيلها بفراغ لبدء إزالة الغازات على لوح التحريك لمدة 1 ساعة على الأقل.
2. في عمود كروماتوغرافيا زجاجي مقاس 1.0 سم × 30 سم مع إغلاق سدادة الدوران ، أضف PBS إلى العمود لغسله. افتح سدادة الدوران واستنزف العمود. بعد الغسيل ، أضف ملاط الخرز منزوع الغازات إلى العمود. أضف الملاط باستمرار حتى يتم تعبئة العمود بارتفاع حبة يبلغ حوالي 24 سم.
3. بمجرد أن يكون للعمود "رأس" يبلغ حوالي 4-5 سم من PBS فوق الخرز المعبأ ، جهز الخطوات التالية.
   1. قم بإنشاء سيفون تدفق الجاذبية عن طريق قياس قطعة من الأنبوب بطول كاف للوصول إلى رف من 1 إلى 2 قدم فوق الجزء العلوي من العمود وإنشاء حلقة تسقط بالقرب من الجزء السفلي من العمود وتعود إلى أعلى العمود. أضف سدادة دوران إلى أحد طرفي الأنبوب ، واترك جانبا واحدا من الأنبوب مفتوحا. ضع طرف الأنبوب المفتوح في زجاجة سعة 500 مل من PBS وضعه على الرف فوق العمود.
   2. خذ النهاية بسدادة الدوران وقم بإرفاق حقنة سعة 10 مل. افتح صمام سدادة الدوران على خط الأنبوب وارسم PBS عبر الأنبوب. بمجرد وصول PBS إلى ثلاثة أرباع الطريق عبر الأنبوب ، قم بإزالة المحقنة بسرعة وأضف سدادة الدوران إلى أعلى العمود - يجب أن يتدفق السائل على العمود.
      ملاحظة: يجب أن يتراوح مقدار "رأس" PBS المتبقي في الجزء العلوي من العمود بين 1 و 3 سم. الحد الأدنى لغسل العمود هو 3 أحجام أعمدة.
4. تحديد كمية البروتين (الشامات) التي سيتم ربطها بالدهون بناء على وزنه الجزيئي (MW).
   ملاحظة: يتم استخدام جزء Fab من الغلوبولين المناعي المضاد للفأر للماعز ، IgM (في حد ذاته IgG) هنا كمستضد بديل عالمي للتحفيز متعدد النسيلة للخلايا البائية. وفقا لذلك ، فإن جزء Fab من الماعز IgG يحتوي على ميغاواط يبلغ حوالي 48 كيلو دالتون (كيلو دالتون) وهو متوفر تجاريا بكمية إجمالية قدرها 1.3 مجم. وبالتالي ، فإن كمية البروتين المراد ربطها هي 27.1 ميكرومول.
5. تحديد معامل انقراض البروتين محل الاهتمام. إذا لم يكن معروفا ، فقم بقياس امتصاص البروتين عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي واقسم قيمة A₂₈₀ على عدد المولات المحسوبة في الخطوة 1.4.
   ملاحظة: معامل انقراض Fab of IgG عند 280 نانومتر هو 64,600 ^M-1.
6. لضمان إزالة كميات ضئيلة من المخزن المؤقت المحتوي على الأمين ، قم بتحلية البروتين الموجود على العمود الذي تم إنشاؤه في الخطوات 1.1-1.3 وجمع أجزاء البروتين في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل (~ 500 ميكرولتر لكل كسر).
   1. أغلق صمام سدادة الدوران المتصل بالجزء العلوي من العمود وقم بإزالة الجزء العلوي من العمود. إذا لم يكن مفتوحا بالفعل ، فافتح صمام سدادة الدوران في الجزء السفلي من العمود وانتظر حتى يصل "رأس" PBS إلى الجزء العلوي من الخرز.
   2. أضف البروتين محل الاهتمام ببطء إلى الجزء العلوي من الخرزات باستخدام ماصة باستور زجاجية ، مع الحرص على تقليل الاضطراب في الجزء العلوي من الخرز.
   3. بمجرد وصول "رأس" محلول البروتين إلى الجزء العلوي من الخرز، أضف 1 مل من PBS برفق عبر ماصة باستور. كرر ثلاث مرات. أضف PBS لإنشاء رأس من 4-5 سم وكرر الخطوة 1.3 لغسل العمود.
      ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان من المؤكد عدم وجود مخزن مؤقت يحتوي على أمين.
7. حدد الكسور التي تحتوي على البروتين عن طريق قياس قيم A280 وتجميع الكسور التي تعطي ما يقرب من 90٪ من استعادة البروتين. < / > ملاحظة: هذا عادة ما يخفف البروتين 1.5-2 ضعف. حدد تركيز البروتين بعد التجميع. ركز البروتين في هذه الخطوة ، إذا لزم الأمر ، باستخدام مكثف الطرد المركزي.
8. أضف 2.5 مكافئ مولار من الرابط المتشابك غير المتجانس إلى البروتين.
   1. أولا ، قم بوزن ما يقرب من 5 مجم من السكسينيميديل 3- (2-بيريديلديثيو) بروبيونات (SPDP ، MW = 314 جم / مول) في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. لتحديد حجم إذابة SPDP ، تركيز البروتين المولي takmultiplye و 250x لتوليد محلول 100x يعطي فائضا قدره 2.5 مولار في التفاعل. < / > ملاحظة: على سبيل المثال ، إذا كان تركيز البروتين 50 ميكرومتر ، فستكون هناك حاجة إلى محلول SPDP عند 12.5 مليمتر. بالنسبة ل 5 ملغ من SPDP ، يتوافق هذا مع 1.27 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
9. أضف SPDP إلى البروتين محل الاهتمام عند تخفيف 1: 100. ضع التفاعل على شاكر متذبذب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة تقريبا.
10. لإزالة SPDP الزائد وحماية رابطة ثاني كبريتيد داخلية المنشأ ، في البروتين في خطوة الاختزال اللاحقة ، قم بموازنة وغسل العمود الذي تم إنشاؤه في الخطوات 1.1-1.3 في 100 ملي من أسيتات الصوديوم (NaOAc) عند درجة الحموضة 5.5 أو إنشاء عمود متطابق للاستخدام فقط في هذا المخزن المؤقت.
11. بعد 1 ساعة من الحضانة مع SPDP ، قم بتحلية البروتين الموجود على العمود المتوازن في 100 ملي مولار من NaOAc. قم بتنفيذ هذه الخطوة بطريقة مماثلة للخطوة 1.6 باستثناء استخدام 100 ملي مولار NaOAc (الرقم الهيدروجيني 5.5) كمادة مزوية. اجمع الكسور ، وحدد A₂₈₀ ، وجمع الكسور العليا. اغسل العمود في PBS.
12. تحضير محلول 2.5 متر من DTT (MW = 154 جم / مول) في ماء مقطر مزدوج (ddH₂O). أضف 25 ملي مولار DTT إلى أجزاء البروتين المجمعة لمدة 5-10 دقائق.
13. قم بقياس A₂₈₀ من البروتين وقسمه على معامل الانقراض. أيضا ، حدد A₃₄₃. احسب نسبة الربط بناء على مولارية البروتين (A₂₈₀) والرابط (A₃₄₃).
    ملاحظة: قم بإيقاف تشغيل المعايرة التلقائية A340 إذا كنت تستخدم مقياس الطيف الضوئي النانوي. يمثل القياس A₃₄₃ امتصاص مجموعة البيريدين 2-thione (معامل الانقراض = 7550 ^M-1) التي تمت إزالتها من الرابط المتقاطع SPDP بواسطة DTT. يتم تحقيق نسبة مولية من الرابط: نسبة البروتين من 1.2 إلى 1.5 بشكل عام عند إجراء التفاعل مع زيادة 2.5 مولار من SDPD على مجموعة واسعة من البروتينات.
14. قم بتشغيل الكسور المجمعة فوق العمود المغسول في PBS كما هو موضح أعلاه. اجمع الكسور ، وحدد A₂₈₀ ، وتجمع الكسور العلوية. حدد تركيز البروتين بواسطة A280 بعد تجميع الكسور.
15. تحضير DSPE-PEG (2000) -Maleimide (1،2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [ميثوكسي (بولي إيثيلين جلايكول) -2000) -Maleimide. سيتم إضافة هذا إلى البروتين بنسبة 10: 1. قم بإعداد مخزون 100x من DSPE-PEG (2000) -Maleimide لتحقيق التركيز المطلوب.
    1. على سبيل المثال ، إذا كان تركيز البروتين 10 ميكرومتر بعد الخطوة 1.14 ، فقم بإعداد مخزون من DSPE-PEG (2000) -Maleimide عند 10 ملليمتر. قم بوزن DSPE-PEG (2000) -Maleimide بعناية (MW = 3000 جم / مول) وأضف الكمية المناسبة من DMSO. جولات متعددة من الدوامة اللطيفة والصوتنة قد تجعلها تذوب تماما.
16. حدد الحجم الكلي للكسور من الخطوة 1.14 وانقل المحلول بعناية إلى قارورة سفلية مستديرة صغيرة (10-25 مل) (RBF). أضف الكمية المناسبة من 100x DSPE-PEG (2000) -Maleimide إلى البروتين لتحقيق تركيز نهائي فائض 1x و 10 أضعاف. قم بتدوير المحلول برفق للتأكد من تشتيت DMSO بالكامل.
17. قم بتشغيل التفاعل طوال الليل تحت النيتروجين في RBF محكم الغلق. استخدم حاجزا مطاطيا وضعه في غطاء الدخان.
    1. قم بإزالة الغلاف الجوي عن طريق ثقب الحاجز بإبرة 20 جم متصلة بحقنة سعة 3 مل في نهاية الأنبوب المتصل بالمكنسة الكهربائية ، وقم بتشغيل الفراغ لمدة 3-5 ثوان.
    2. استبدل الغلاف الجوي بالنيتروجين. املأ بالونا متصلا بحقنة سعة 3 مل مقطعة إلى نصفين بالنيتروجين وقم بإرفاق إبرة 20 جراما. ثقب الحاجز لملء الغلاف الجوي داخل قارورة القاع المستديرة بالنيتروجين. كرر إزالة الغلاف الجوي واستبداله بالنيتروجين مرة أخرى واترك بالون النيتروجين متصلا طوال الليل.
18. قم بإعداد عمود منفصل من حبة جل ديكستران متشابك مع نطاق تجزئة يتراوح بين 4,000-150,000 دالتون في عمود كروماتوغرافيا زجاجي 1.0 سم × 50 سم (وفقا للخطوات 1.1-1.3).
19. في اليوم التالي ، قم بإزالة البروتين من القارورة السفلية المستديرة المحضرة في الخطوة 1.17 وقم بتشغيلها (اتبع الطريقة المستخدمة في الخطوة 1.6) فوق عمود حبة جل ديكستران المتشابك (من الخطوة 1.18).
    ملاحظة: يجب ألا يزيد المبلغ الإجمالي للتحميل على العمود عن 2 مل. إذا تم استخدام تفاعل أكبر ، فقم بتقسيمه إلى قسمين وتشغيله على أعمدة منفصلة أو تشغيل على عمود بقطر أكبر.
    1. اجمع الكسور ، وحدد A₂₈₀ ، وتجمع الكسور العلوية ، وحدد تركيز البروتين. لن يؤثر وجود الدهون على القياسات.
20. قم بتخزين الأجزاء النهائية المجمعة من البروتين المرتبط بالدهون في 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

فئة

2. تحضير الجسيمات الشحمية

1. وزن الدهون: DSPE-PEG (2000) (1،2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [ميثوكسي (بولي إيثيلين جلايكول) -2000 ، ميغاواط = 2805.5 جم / مول ؛ الكوليسترول (3b-هيدروكسي-5-كوليستين, 5-Cholesten-3b-ol), MW = 386.7 g/mol; و DSPC (1،2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) ، ميغاواط = 790.1 جم / مول. قم بإنشاء محلول 5 مجم / مل من DSPC ، و 4 مجم / مل محلول من الكوليسترول ، و 2 مجم / مل من محلول DSPE-PEG (2000) في الكلوروفورم.
2. تأكد من أن النسبة المولية للدهون في الجسيمات الشحمية هي: 57٪ DSPC ، و 38٪ كوليسترول ، و 5٪ DSPE-PEG (2000) ، كما هو موضح في الجدول 1.
   ملاحظة: من المهم التحكم في كمية المستضد على الجسيم الشحمي ، والتي تتراوح بشكل عام من 0.01 إلى 0.1٪. في الجدول 1 ، يتم استخدام 0.1٪ من جزء IgM Fab المضاد للفأر المرتبط بالدهون PEGylated. من الأهمية بمكان مراعاة الفائض المولي البالغ 10 أضعاف من DSPE-PEG (2000) -Maleimide الذي تمت إضافته إلى البروتين في الخطوة 1.15 ، للتأكد من أن الكمية الإجمالية للدهون PEGylated لا تتجاوز 5٪.
3. ضع في اعتبارك كميات الدهون النهائية (ميكرومول) عند إنشاء دهون للبثق. انظر الجدول 1 للحصول على مثال لحساب تركيزات الدهون المولية لإنشاء الجسيمات الشحمية بتركيز إجمالي للدهون يبلغ 1.25 ميكرومتر.
4. بمجرد حساب الكمية الصحيحة لكل دهون يتم إضافتها معا ، اجمع الكل في أنبوب اختبار زجاجي من البورسليكات سعة 12 مل.
5. تفجير الكلوروفورم بعناية.
   1. استخدم الأنبوب وحقنة سعة 3 مل بإبرة ، محضرة في الخطوة 1.17.1 ، لتفجير الكلوروفورم بعناية في الأنبوب بالنيتروجين. قم بنفخ تيار من النيتروجين برفق على المحلول أثناء تدوير الأنبوب باليد الأخرى. احرص على تقليل الرش أو التسبب في جريان السائل إلى جانب الأنبوب حيث قد يكون من الصعب إدخالها في المحلول في الخطوة التالية.
6. أضف 100 ميكرولتر من DMSO إلى كل أنبوب وقم بتجميد هذا المحلول طوال الليل. قم بتغطية الجزء العلوي من الأنبوب بمنديل مختبري غير ثابت ، وثبته بشريط مطاطي ، وقم بتجميده عند -80 درجة مئوية.

فئة

3. بثق الجسيمات الشحمية

1. أضف 1 مل من PBS الذي يحتوي على البروتين المرتبط بالدهون إلى أنبوب 12 مل الذي يحتوي على الدهون. Sonicate الحل لمدة 30 ثانية تقريبا إلى 1 دقيقة في حمام مائي صوتنة. استرح لمدة 5 دقائق أو أكثر بين كل جولة وكرر 3-4 مرات.
2. قم بإعداد الطارد حسب توجيهات الشركة المصنعة.
   1. أضف دعامات المرشح إلى دعامة الغشاء الداخلي ، وضع بضع قطرات (10 ميكرولتر لكل منها) من PBS على فيلم البارافين. باستخدام الملقط ، أمسك حافة دعامة المرشح واغمسها في قطرة 10 ميكرولتر.
   2. ضع الفلتر داخل الحلقة O. افعل هذا لكلا الجانبين. باستخدام الملقط ، أمسك بمرشح 0.8 ميكرومتر على الحافة في قطرة 10 ميكرولتر ، وقم بتغطية الجزء الخارجي من الحلقة O باستخدام PBS. ضع المرشح 0.8 ميكرومتر برفق على الحلقة O حتى لا يتدلى الفلتر من دعامة الغشاء الداخلي.
3. ضع كتلة تسخين الطارد على لوح ساخن لتسخين الطارد مسبقا. قم بتبديل اللوح الساخن على درجة منخفضة واسمح لكتلة تسخين الطارد بالوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. لتجنب المشكلات المحتملة المتعلقة بتجميع البروتين ، لا تقم بتسخين الكتلة بعد 37 درجة مئوية.
4. قم بتحميل العينة الصوتية في إحدى محاقن البثق الموضوعة في الطارد. ضع حقنة الطارد في الطرف الآخر من الطارد. تأكد من ضبط مكبس المحقنة الفارغة على الصفر. سوف تمتلئ المحقنة الفارغة حيث يتم بثق الدهون من خلال غشاء البولي كربونات 0.8 ميكرومتر. حاول تجنب تمرير الفقاعات ذهابا وإيابا عبر الغشاء.
5. ضع الطارد المجمع بالكامل في كتلة التسخين. ادفع برفق مكبس المحقنة المملوءة بالدهون إلى المحقنة الفارغة. اعتمادا على تركيز الدهون ، سيكون من الصعب دفع ذلك. كرر 20x.
6. قم بإزالة الطارد المجمع بالكامل من كتلة التسخين. قم بإزالة المحقنة المملوءة ببطء من الطارد ، وتأكد من جمع أي دهون قد تتسرب عند الإزالة. ضع الجسيمات الشحمية في قارورة نظيفة. كرر الخطوات 3.4-3.6 باستخدام أغشية البولي كربونات 0.2 ميكرومتر و 0.1 ميكرومتر.
7. قم بإنشاء عمود حبة الاغاروز المتقاطع مقاس 0.7 × 50 سم مع نطاق فصل يتراوح بين 0.7-10 ميجا دالتون (MDa) متوازن في PBS. أضف الجسيمات الشحمية وقم بتشغيلها كما في الخطوة 1.6. ستقل الكسور التي تحتوي على الجسيمات الشحمية من انتقال الضوء في نطاق 250-400 نانومتر.
8. قم بتخزين الجسيمات الشحمية في درجة حرارة 4 درجات مئوية ولا تجمد.

< p class = "jove_title" >4. تدفق الكالسيوم لمراقبة تنشيط الخلايا البائية بواسطة الجسيمات الشحمية المستضدية

1. القتل الرحيم للفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربون (_{CO 2}) أو جرعة زائدة من الأيزوفلوران ، وفقا لإجراءات التشغيل القياسية المؤسسية. تأكيد القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
2. تعقيم الأدوات الجراحية وجثة الفئران باستخدام 70٪ من الإيثانول. استخدم ملقط قزحية منحني بطول 10 سم وطرف 0.8 مم لفصل الجلد الذي يغطي تجويف الصدر عن القفص الصدري. استخدم مقصا مستقيما بطول 10 سم لعمل شق بعيد بشق ثنائي.
3. استخدم ملقط القزحية المنحني ومقص تشريح لاستخراج الطحال من تجويف البطن. قم بإزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالطحال ثم ضعها في أنبوب مخروطي بوليسترين سعة 15 مل مملوء بوسط RPMI1640 يحتوي على 1٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) ، والبنسلين والستربتومايسين.
4. انقل الطحال والوسائط فوق مصفاة خلية 40 ميكرومتر مثبتة على أنبوب مخروطي سعة 50 مل. باستخدام الطرف المطاطي لمكبس حقنة سعة 3 مل ، قم بسحق الطحال برفق. اغسل مصفاة الخلية 40 ميكرومتر بالوسائط. كرر هذه العملية حتى يتبقى الأنسجة الدهنية فقط في مصفاة الخلايا 40 ميكرومتر. اشطف المنخل ب 3-5 مل من الوسائط لزيادة استعادة الخلايا.
5. تتجانس خلايا الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأضف 10 مل من 1x مخزن تحلل كرات الدم الحمراء إلى الحبيبات. الماصة لأعلى ولأسفل ، واتركها لمدة 2-3 دقائق في RT ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
6. تخلص من المادة الطافية خلايا الطحال المستنفدة لخلايا الدم الحمراء في 10 مل من الوسائط. حدد إجمالي عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو أي جهاز آخر لعد الخلايا. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
   ملاحظة: التركيز النهائي المثالي اللازم لتحميل الخلايا الطحالية Indo-1 هو 10-20 × 10⁶ خلايا / مل ، ولكن يمكن استخدام تركيز أقل من الخلايا.
7. أعد تعليق خلايا الطحال عند 15 × 10⁶ خلايا / مل في عازلة تحميل تدفق الكالسيوم (معهد روزويل بارك التذكاري ، وسط RPMI1640 يحتوي على 1٪ FCS ، 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، 1 ملي كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂) ، 1 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'، N'-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) ، و 5٪ بنسلين ستربتومايسين). أضف 1.5 ميكرومتر من Indo-1 من محلول مخزون DMSO 1 ملي مولار ، واقلب الأنبوب عدة مرات للخلط. احمها من الضوء ، واحتضن الخلايا عند حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
8. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، أضف 5 أضعاف كمية المخزن المؤقت لتحميل تدفق الكالسيوم. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 7 دقائق في RT.
9. للبوابات على الخلايا البائية ، قم بتلطيخ الخلايا مع 1: 200 CD5-PE مضاد للفأر ومضاد للفأر 1: 200 B220-PE / Cy7 في 0.5 مل من عازل التحميل عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ، محمي من الضوء.
10. اغسل خلايا الطحال في عازلة تحميل تدفق الكالسيوم وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 7 دقائق في RT. أعد تعليق الخلايا عند 10-20 × 10⁶ خلايا / مل في المخزن المؤقت لتدفق الكالسيوم (محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) الذي يحتوي على 1٪ FCS و 1 ملي مولار MgCl₂ و 1 ملي مولار من كلوريد الكالسيوم (CaCl₂)). يحفظ على الثلج ، محميا من الضوء حتى يصبح جاهزا للتشغيل على مقياس التدفق الخلوي.
11. قم بإعداد قياس التدفق الخلوي باستخدام أدوات التحكم في البقع غير الملوثة والمفردة للتعويض.
    1. قم بتشغيل الخلايا الملطخة لإعداد البوابات بشكل مناسب (انظر الشكل 1 أ). قم بإعداد Indo-1 (البنفسجي) مقابل Indo-1 (الأزرق) ، واضبط الفولتية في قنوات Indo-1 لوضع تلطيخ الخلايا على منحدر 45-60 درجة لتعظيم الإشارة: نسبة الضوضاء للبنفسجي Indo-1: التغيير الأزرق في النسبة بعد تحفيز الخلايا البائية.
       ملاحظة: تأكد من أن الفولتية ليست عالية جدا ، بحيث تكون نسبة كبيرة من الخلايا (>5٪) مقابل الجزء العلوي من المؤامرة.
    2. قم بإنشاء بوابة قطرية تغلف الجزء العلوي الأيسر (البنفسجي ⁺ الأزرق^-) من المؤامرة ، بحيث تكون <10٪ من الخلايا في البوابة بدون تحفيز ، والتي يجب أن تزيد بشكل مثالي إلى >75٪ بعد التحفيز.
12. أضف 0.5 مل من الخلايا إلى أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل (أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)) وقم بتسخين الخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق في حمام مائي. ضع أنبوب FACS في الغرفة المغطى بالماء 37 درجة مئوية المتصلة بحمام مائي معاد تدويره.
    1. قم بتشغيل الأنبوب في سترة الماء على مقياس التدفق الخلوي وابدأ الاستحواذ ، دون تخزين البيانات ، عند ما يقرب من 5,000-10,000 حدث / ثانية. بمجرد استقرار الخلايا (15-30 ثانية) ، ابدأ الحصول على البيانات واجمع البيانات لمدة 10 ثوان على الأقل لإنشاء الخلفية.
    2. عند علامة 10 مخاط ، قم بإزالة الأنبوب بسرعة من مقياس التدفق الخلوي ، وأضف التحفيز (5-50 ميكرومتر من الجسيمات الشحمية المستضدية في 2-20 ميكرولتر) ، ودوامة النبض ، وأعد أنبوب FACS إلى مقياس التدفق الخلوي. حافظ على الحصول على البيانات وتخزينها خلال هذا الوقت واجمع البيانات لمدة 3-5 دقائق.
13. تحليل البيانات في برنامج التحليل المناسب تحت وظائف الحركية.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: حسابات لإنشاء جسيم شحمي بتركيز إجمالي 1.25 ميكرومتر.مثال على جدول الحساب للجسيمات الشحمية الشظية IgM F (ab) المضادة للفأر.

ميغاواط 790 387 ريال 2900 3000 ريال 48000 ريال DSPC كولسترول PEG-DSPE PEG-DSPE الزائد aIgM-PEG-DSPE مجموع نسبة المولية 57 38 3.9 1 0.1 100.00 الكتلة (ملغ) 0.56 0.18 0.14 دولار 0.04 0.06 0.98 مليمول 0.71 0.47 0.05 0.01 0.00 1.25 مل 112.50 45.93 ربيع 70.64 دولار 0.00 525.97 755.03 دولار Conc. (ملغم / مل) DSPC 5 كولسترول 4 PEG-DSPE 2 aIgM-PEG-DSPE 0.114

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: استراتيجية البوابات التمثيلية ونتائج تدفق الكالسيوم والتحليل.(أ) تم تحليل الخلايا من خلال استراتيجية البوابات التالية: الخلايا الليمفاوية الحية (FSC-A مقابل SSC-A) ، والخلايا المفردة (FSC-W مقابل SSC-W) ، والخلايا البائية (B220 ⁺ CD5^-). (ب) استجابة التدفق الهندي 1 / Ca²⁺ (البنفسجي مقابل ا...

المواد