< ص الفئة = "jove_title" >
1. تحضير مركز الحويصلة خارج الخلية (EV) المتفطرة السلية الخام (Mtb)
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: للحصول على إجراءات مفصلة حول زراعة Mtb وتحضير بروتين ترشيح المزرعة (CFP). من المستحسن أن تكون وسائط الاستزراع البكتيرية خالية من مكملات النمو التي تحتوي على مكونات تحتوي على EV أو البروتينية ، مثل Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC) ، والمنظفات مثل Tween. يوصى أيضا بفحص جودة الثقافة البكتيرية وCFP المحصودة لضمان موت الخلايا وتحللها بشكل محدود.
- قم بإعداد مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) (انظر جدول المواد) عن طريق إضافة سعة الحجم الكاملة للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (1x PBS). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 2,800 × جم عند 4 درجات مئوية < / >
ملاحظة: عنداستخدام مرشح بدون حجم توقف مسدود ، يجب توخي الحذر لضمان عدم تقليل حجم العينة إلى ما دون مستوى المرشح ، مما يؤدي إلى تجفيف الفلتر بالكامل أثناء الطرد المركزي.
- تخلص من التدفق وأي PBS متبقي قبل ملء غرفة العينة ب Mtb CFP إلى أقصى سعة. جهاز طرد مركزي عند 2,800 × جم عند 4 درجات مئوية حتى ينخفض الحجم إلى الحد الأدنى لحجم جهاز الترشيح الفائق. كرر حسب الضرورة ، مع إضافة المزيد من CFP إلى الوحدة حتى يتم تقليل العينة بأكملها بشكل كاف.
ملاحظه: احتفظ بجزء من مادة التدفق 100 كيلو دالتون (100 فهرنهايت) للتأهيل النهائي إذا رغبت في ذلك. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- أضف 1x PBS إلى وحدة المرشح التي تحتوي على التركيز حتى السعة الإجمالية للجهاز. تقليل الحجم كما هو موضح في 1.2. كرر هذه الخطوة خمس مرات لضمان الغسيل الكامل واستبدال العازلة.
- استرجع احتفاظ CFP المركز 100 كيلو دالتون (100R) وفقا لمواصفات جهاز الترشيح الفائق (انظر جدول المواد). بمجرد استرداد 100R ، اغسل الفلتر بحجم لا يقل عن 1x PBS ثلاث مرات على الأقل ، وقم بتجميع الغسيل باستخدام 100R لزيادة الاسترداد.
- قم بقياس كمية مادة 100R باستخدام مقايسة bicinchoninic (BCA) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). لإجراء الفحص ، استخدم عدة تخفيفات للعينات 1: 2 و 1: 5 و 1:10 في PBS. اختبر العينة بثلاث نسخ.
ملاحظه: احتفظ بجزء من مادة 100R للتأهيل النهائي إذا رغبت في ذلك. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
