فئة
1. تحضير مركز Mtb EV الخام
ملاحظة: للحصول على إجراءات مفصلة حول زراعة Mtb وتحضير بروتين ترشيح الثقافة (CFP) ، انظر المراجع. من المستحسن أن تكون وسائط الاستزراع البكتيرية خالية من مكملات النمو التي تحتوي على مكونات تحتوي على EV أو البروتينية ، مثل Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC) ، والمنظفات مثل Tween. يوصى أيضا بفحص جودة الثقافة البكتيرية وCFP المحصودة لضمان موت الخلايا وتحللها بشكل محدود.
- قم بإعداد مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) (انظر جدول المواد) عن طريق إضافة سعة الحجم الكاملة للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (1x PBS). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 2,800 × جم عند 4 درجات مئوية < / >
ملاحظه: في حالة استخدام مرشح بدون حجم توقف مسدود ، يجب توخي الحذر لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى ما دون مستوى المرشح ، مما يؤدي إلى تجفيف الفلتر بالكامل أثناء الطرد المركزي.
- تخلص من التدفق وأي PBS متبقي قبل ملء غرفة العينة ب Mtb CFP إلى أقصى سعة. جهاز طرد مركزي عند 2,800 × جم عند 4 درجات مئوية حتى ينخفض الحجم إلى الحد الأدنى لحجم جهاز الترشيح الفائق. كرر حسب الضرورة ، مع إضافة المزيد من CFP إلى الوحدة حتى يتم تقليل العينة بأكملها بشكل كاف.
ملاحظه: احتفظ بجزء من مادة التدفق 100 كيلو دالتون (100 فهرنهايت) للتأهيل النهائي إذا رغبت في ذلك. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- أضف 1x PBS إلى وحدة المرشح التي تحتوي على التركيز حتى السعة الإجمالية للجهاز. تقليل الحجم كما هو موضح في 1.2. كرر هذه الخطوة خمس مرات لضمان الغسيل الكامل واستبدال العازلة.
- استرجع احتفاظ CFP المركز 100 كيلو دالتون (100R) وفقا لمواصفات جهاز الترشيح الفائق (انظر جدول المواد). بمجرد استرداد 100R ، اغسل الفلتر بحجم لا يقل عن 1x PBS ثلاث مرات على الأقل ، وقم بتجميع الغسيل باستخدام 100R لزيادة الاسترداد.
- قم بقياس كمية مادة 100R باستخدام مقايسة bicinchoninic (BCA) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). لإجراء الفحص ، استخدم عدة تخفيفات للعينات 1: 2 و 1: 5 و 1:10 في PBS. اختبر العينة بثلاث نسخ.
ملاحظه: احتفظ بجزء من مادة 100R للتأهيل النهائي إذا رغبت في ذلك. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
< p class = "jove_title" >
2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لإثراء Mtb EVs من CFP
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: الإجراء التالي محدد لاستخدام 3 مجم من 100R Mtb CFP مع عمود SEC ومجمع الكسور التلقائي (AFC ، انظر
جدول المواد). يمكن تكييفه مع تركيزات البداية وأنواع الأعمدة الأخرى باتباع مواصفات الشركة المصنعة. بالإضافة إلى ذلك ، ينصح المستخدمون بقراءة وفهم دليل مستخدم مجمع الكسور التلقائي.
- اسمح لعمود SEC بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة.
- قم بتشغيل AFC باستخدام مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من وحدة البرج واضبط إعدادات خلية التحميل، إذا لزم الأمر، بالضغط على SETUP على شاشة اللمس في القائمة الرئيسية. يجب معايرة خلية الحمل فقط عند الاستخدام الأول ، وبعد كل تحديث للبرنامج ، وفي حالة ملاحظة عدم تناسق في وحدات تخزين الكسور.
- من شاشة SETUP ، قم بمحاذاة العرض الدوار عن طريق تحديد CAROUSEL > CALIBRATE. أدخل الرف الدوار بحيث تكون الثقوب الصغيرة ال 13 متجهة لأعلى في برج AFC ، واضبط الرف الدوار بحيث تكون فوهة السائل أعلى موضع التدفق مباشرة بالضغط على الزرين - و / أو +.
- قم بإزالة الأحرف الكبيرة من عمود SEC المتوازن. حرك عمود SEC في حامل العمود المناسب وقم بتثبيته بعناية على برج AFC. تأكد من أن علامة تحديد التردد اللاسلكي (RFID) الموجودة على العمود تواجه AFC ، وتحقق من أن الاتصال بين العمود والصمام آمن. ضع أنبوب مخرج النفايات في حاوية تجميع.
- من شاشة الإعداد ، حدد جدول المجموعة واضبط العد على 13 والحجم إلى 0.5 مل بالضغط على الزرين - و / أو +. اترك إعداد "وحدة تخزين المخزن المؤقت" كإعداد افتراضي يبلغ 2.7 مل ، ثم أغلق نافذة "جدول التحصيل" بالضغط على X.
- حدد بدء المجموعة من الشاشة الرئيسية وقم بتأكيد معلمات المجموعة عن طريق تحديد نعم. قم بتحميل 13 أنبوبا من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل مع فتح الأغطية وتوجيهها نحو مركز الدوارات.
- تقدم AFC عن طريق تحديد موافق، ثم قم بتركيب خزان العمود وتقدم مرة أخرى بالضغط على موافق. حدد خيار مسح العمود بالضغط على نعم، وأضف وحدة تخزين عمود واحدة بحجم 0.2 ميكرومتر PBS تمت تصفيته لإزالة أي مخزن مؤقت للتخزين. بمجرد اكتمال التدفق ، قم بدفع AFC بالضغط على موافق.
- ضع الغطاء الدائري فوق AFC واضغط على موافق. قم بإعداد حجم عمود واحد بحجم 0.2 ميكرومتر من PBS المصفى. استخدم ماصة لإزالة أي مخزن مؤقت زائد من العمود.
- أحضر 3 ملغ من عينة 100R كما هو محدد في الخطوة 1.5 إلى 500 ميكرولتر مع 1x PBS. أضف عينة 3 مجم إلى أعلى العمود. تقدم AFC واسمح للعينة بالركض في الفريت. بمجرد دخول العينة بالكامل إلى العمود ، أضف PBS المعد في الخطوة 2.6 إلى الخزان.
- راقب تشغيل AFC أثناء قيامه بجمع وحدة تخزين الفراغ أولا ثم الكسور المحددة. بعد اكتمال التشغيل وعودة الرف الدائري إلى وضع النفايات ، قم بإزالة الغطاء وإزالة أنابيب الكسر من الرف الدائري. قم بتخزين الكسور عند 4 درجات مئوية قبل القياس الكمي (الخطوة 3) والتأهيل (الخطوة 4).
- إذا كان سيتم إعادة استخدام العمود، فحدد خيار تنظيف العمود بالضغط على نعم؛ وإلا، اضغط على لا. اتبع التعليمات الموجودة على AFC.
ملاحظة: بمجرد غسل العمود وتشغيل المخزن المؤقت للتخزين ، يمكن إزالته وتغطيته وتخزينه عند 4 درجات مئوية.