تقنية zWEDGI لتصور يرقات الزرد المصابة بممرضات الفطريات

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Thrikawala، S. et al.، إصابة يرقات الزرد بجراثيم الرشاشيات لتحليل التفاعلات بين المضيف والممرض.J. Vis. Exp.(2020)

يوضح الفيديو تقنية جهاز جرح وانحباس أسماك الزرد لمراقبة عدوى مسببات الأمراض الفطرية المسماة بالفلورسنت في يرقات أسماك الزرد. تجذب العدوى الأولية البلاعم ، ومع استمرار العدوى ، يتقدم تجنيد العدلات في موقع الحقن.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title">1. تحضير جراثيم الرشاشيات للحقن

1. من تعليق بوغ الرشاشيات ، احسب الحجم اللازم للحصول على 1 × 10⁶ جراثيم. يجب أن يكون الحجم 20-100 ميكرولتر ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإنتاج تخفيف 10x في 0.01٪ (حجم / حجم) معقم Tween-20 (Tween-water; جدول المواد). على سبيل المثال ، إذا كان الحجم المحسوب هو 5 ميكرولتر ، فقم بإنتاج تخفيف 10x واستخدم 50 ميكرولتر من المحلول المخفف.
   ملاحظه: يمكن تحضير لوحين / سلالات لجمع المزيد من الجراثيم أو كاحتياطي في حالة التلوث.
2. انشر 1 × 10⁶ جراثيم الرشاشيات على لوحة واحدة من وسائط الجلوكوز الدنيا (GMM) (جدول المواد) باستخدام موزعة معقمة على شكل حرف L يمكن التخلص منها في خزانة السلامة الحيوية. تجنب الانتشار إلى هامش اللوحة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام ، بحيث تكون اللوحة مقلوبة رأسا على عقب.
3. في يوم التجميع ، أحضر القماش المعقم و 50 مل من الأنابيب المخروطية (اثنان لكل سلالة) ، وزجاجات جديدة من ماء Tween المعقم (واحدة لكل سلالة) ، وموزعات معقمة على شكل حرف L إلى خزانة السلامة الحيوية.
   ملاحظه: يمكن تقطيع Miracloth إلى ~ 8 × 6 قطع ، ملفوفة بورق الألمنيوم ، وتعقيمها لتعقيمها.
4. ضع قطعة واحدة من القماش في كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأعد الغطاء. أخرج كيس miracloth المتبقي من الغطاء.
5. أحضر اللوحات إلى خزانة السلامة الحيوية. افتح طبقا واحدا ، ثم اسكب ماء توين في الأعلى لتغطية حوالي ثلاثة أرباع اللوحة.
6. باستخدام موزعة يمكن التخلص منها على شكل حرف L ، اكشط سطح المزرعة الفطرية برفق بحركة ذهابا وإيابا ، مع استخدام اليد الأخرى لتدوير اللوحة. اكشط حتى تتجانس جميع الجراثيم تقريبا في ماء Tween.
   ملاحظه: بسبب الكراهية العالية للماء ، يمكن أن تخلق الجراثيم "نفثا" عند إضافة ماء Tween أو أثناء الكشط. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تلوث الأنابيب أو الألواح القريبة. ينصح بتغيير القفازات ومسح السطح بنسبة 70٪ من الإيثانول بين استخراج سلالات مختلفة.
7. خذ أنبوبا مخروطيا واحدا سعة 50 مل وقم بإزالة قطعة القماش الميرا. قم بطيها إلى نصفين وتحويلها إلى مرشح يتم إدخاله في الجزء العلوي من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
8. صب المتجانس الفطري من اللوحة فوق miracloth في الأنبوب.
   ملاحظه: إذا تم تحضير لوحين من سلالة واحدة ، اكشط كلا اللوحين واسكبهما في نفس الأنبوب المخروطي.
9. صب ماء توين ليصل الحجم الكلي في الأنبوب المخروطي إلى 50 مل.
10. قم بالدوران عند 900 × جم لمدة 10 دقائق. تأكد من استخدام أغطية منع الهباء الجوي في جهاز الطرد المركزي.
11. اسكب المادة الطافية في محلول التبييض ~ 10٪ لتطهيرها. صب 50 مل من محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) في الأنبوب المخروطي ، ثم قم بدوامة أو رجها لإعادة تعليق الحبيبات.
12. تدور مرة أخرى عند 900 × جم لمدة 10 دقائق. قم بالتصفية من خلال قطعة جديدة من القماش في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
13. قم بعمل تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف (10x ، 100x ، 1000x) من التجانس الفطري في أنابيب طرد مركزي سعة 1.7 مل (على سبيل المثال ، بالنسبة للمحلول 10x ، امزج 100 ميكرولتر من التجانس الفطري مع 900 ميكرولتر من الماء الصغير).
14. اختر التخفيف الأول الذي لا تكون فيه الجراثيم مرئية عند تصريفها في ماء توين واستخدم هذا التخفيف لحساب عدد الجراثيم باستخدام مقياس كثافة الدم.
15. احسب تركيز الأبواغ في المتجانس الفطري المحضر (معلق الماء) باستخدام الصيغة التالية:
    التركيز (جراثيم / مل) = عدد الجراثيم في الوسط 25 صندوقا × عامل التخفيف × 10⁴
16. قم بإعداد مخزون 1 مل من 1.5 × 10⁸ جراثيم / مل في 1x PBS معقم في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل. يمكن تخزين مستحضر البوغ هذا عند 4 درجات مئوية لمدة ~ 4 أسابيع.
17. قبل الاستخدام في الحقن ، امزج 20 ميكرولتر من تحضير البوغ مع 10 ميكرولتر من الفينول الأحمر المعقم 1٪ في أنبوب طرد مركزي 1.7 مل لتحقيق تركيز بوغ نهائي يبلغ 1 × 10⁸ جراثيم / مل. دوامة جيدا قبل الحقن.
    ملاحظة: يجب تعقيم محلول أحمر الفينول بنسبة 1٪ بالترشيح وتخزينه في حصص.
18. للحصول على حقن وهمي ، امزج 20 ميكرولتر من 1x PBS مع 10 ميكرولتر من 1٪ أحمر الفينول المعقم.

< p class = "jove_title" >2. تحضير ألواح أجار للحقن

1. تحضير 2٪ agarose في وسط E3 وتذوب في الميكروويف.
2. تصب في طبق بتري مقاس 100 مم × 15 مم (~ 25 مل لكل طبق) ، ولفها لتغطية الطبق بالتساوي ، واتركها تبرد.
3. لف الطبق بغشاء البارافين واحفظه مقلوبا عند 4 درجات مئوية.
4. قبل الحقن ، أحضر اللوحة إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
5. صب ~ 1 مل من ألبومين مصل الأبقار المعقم بالفلتر بنسبة 2٪ (BSA) على الطبق ، وقم بإمالة اللوحة لنشرها وتغطية الجزء السفلي بالكامل ، ثم اشطفها ب E3.
   ملاحظة: يمكن تعقيم محلول BSA بنسبة 2٪ بالترشيح وتخزينه على شكل 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية.
6. صب E3 مع التريكيين المخزن على الطبق واتركه حتى الحقن.

فئة < ص = "jove_title" >3. يرقة الزرد الحقن المجهري للبطين الخلفي

1. قم بإزالة اليرقات يدويا باستخدام ملقط عند 2 نقطة في فرن المربع في طبق بتري.
   ملاحظه: يمكن إجراء إزالة التكثيف في أي وقت من 1.5 dpf حتى وقت الحقن.
2. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من E3 من طبق بتري وأضف 300 ميكروغرام / مل من التريكائين في E3 لتخدير اليرقات. < / > ملاحظه: يمكن تحضير محلول مخزون من 4 مجم / مل من التريكيين في E3 وتخزينه عند 4 درجات مئوية. يمكن صنع حل العمل عن طريق تخفيف 4 مل من محلول المخزون حتى 50 مل مع E3.
3. استخدم إعداد الحقن الدقيق المرفق مع حاقن الضغط، ووحدة الضغط الخلفي، ومفتاح القدم، وحامل الماصة الدقيقة، ومعالج دقيق، وحامل ولوحة مغناطيسية، وكلها متصلة بمصدر للهواء المضغوط (جدول المواد).
4. افتح صمام الهواء المضغوط وقم بتشغيل الحاقن الدقيق. اضبط الضغط على ~ 25 رطل لكل بوصة مربعة ، ومدة النبضة على 60 مللي ثانية ، ووحدة الضغط الخلفي على 1 رطل لكل بوصة مربعة (PSI).
5. قم بتحميل إبرة الحقن المجهري باستخدام طرف ماصة اللودر الدقيق (جدول المواد) بحوالي 3-5 ميكرولتر من PBS المحضر أو تعليق بوغ مع الفينول الأحمر. قم بتركيب الإبرة على المعالج الدقيق. < / > ملاحظه: يمكن تحضير إبر الحقن المجهري كما هو موضح سابقا. يجب أن يحتوي المجهر الاستريو المستخدم في الحقن المجهري على شبكة عدسة لمعايرة إبرة الحقن المجهري. يجب معايرة الشبكة باستخدام ميكرومتر المرحلة ، ويجب تحديد طول مقياس الشبكة (ميكرومتر). يتم قياس قطر قطرة تعليق البوغ التي تخرج من الإبرة اعتمادا على عدد التجزئات (من الشبكة) التي تتداخل مع القطرة.
6. ضع المعالج الدقيق بحيث تكون نهاية الإبرة مرئية بأقل تكبير تحت المجهر الاستريو. قم بالتكبير إلى 4x ، مع إبقاء الإبرة في العرض.
7. باستخدام ملقط حاد ، قم بقص نهاية الإبرة. اضغط على دواسة الحقن لتصور حجم القطرة التي تخرج. استمر في القص مرة أخرى حتى يتم حقن ~ 3 نانولتر من تعليق الأبواغ (هنا ، هذه خمس تجزئات).
8. حرك المعالج الدقيق والإبرة بعيدا عن الطريق لتجنب الاصطدام بالإبرة عن طريق الخطأ أثناء ترتيب اليرقات على لوحة الحقن.
9. صب E3-Tricaine من لوحة الحقن ، ثم انقل ~ 24 يرقة مخدرة إلى لوحة الحقن بأقل قدر ممكن من E3 باستخدام ماصة النقل.
10. باستخدام أداة صغيرة لمعالجة يرقات الزرد (أي أداة حلقة الشعر أو أداة الرموش) ، رتب اليرقات وفقا للاتجاه الذي تواجهه. على وجه التحديد ، ضع كل شيء يواجه اليمين في صف واحد ، وكلها تواجه اليسار في صف أدناه.
    ملاحظه: يكون هذا الترتيب صعبا إذا كان هناك الكثير من السوائل على اللوحة ، حيث أن اليرقات سوف "تطفو" في مكانها. ومع ذلك ، فإن القليل جدا من السوائل يمثل مشكلة أيضا إذا استغرقت الحقن وقتا طويلا ، حيث يمكن أن تجف اليرقات أو يتلاشى التخدير. وبالتالي ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لكمية السائل على اللوحة طوال عملية الحقن المجهري بأكملها.
11. اضبط تكبير/تصغير المجهر على أقل تكبير. أعد المعالج الدقيق ورتبه بحيث تكون الإبرة قريبة من اليرقات ، بزاوية ~ 30 درجة - 60 درجة ، في منتصف مجال الرؤية.
12. قم بتكبير أعلى تكبير واستخدم مقابض ضبط دقيقة لضبط موضع الإبرة بشكل أكبر. تحقق من خروج ~ 30-70 جراثيم من الإبرة عن طريق حقن معلق الأبواغ في السائل الموجود على اللوحة المجاورة لليرقات. اضبط الوقت والضغط على إعداد الحقن ، إذا لزم الأمر.
    ملاحظه: يجب تكرار هذا الاختبار كل خمس إلى ست يرقات ، حيث يمكن أن يزيد عدد الجراثيم الخارجة من الإبرة أو ينقص بمرور الوقت.
13. بدءا من الصف الذي تواجه فيه اليرقات نحو الإبرة ، حرك اللوحة بحيث تكون الإبرة أعلى مباشرة وموضوعة بالقرب من اليرقات الأولى.
14. حرك الإبرة باستخدام أداة المعالجة الدقيقة ، أدخل الإبرة عبر الأنسجة المحيطة بالحويصلة الأذنية لتخترق البطين الخلفي للدماغ. حرك اللوحة باليد الأخرى حسب الضرورة للحصول على الاتجاه الصحيح لليرقة بزاوية الإبرة.
15. تحقق بصريا من أن نهاية الإبرة في وسط البطين الخلفي للدماغ ، واضغط على دواسة القدم لحقن الجراثيم ، وسحب الإبرة برفق. < / > ملاحظه: يجب أن تبقى صبغة الفينول الحمراء في المقام الأول داخل البطين الخلفي للدماغ. قد تذهب كمية صغيرة إلى الدماغ المتوسط ، لكن لا ينبغي أن تصل إلى الدماغ الأمامي أو خارج الدماغ. إذا حدث ذلك ، فإن الحجم الذي يتم حقنه يكون كبيرا جدا ، ويجب تقليل الضغط والوقت وفقا لذلك ، أو يجب معايرة إبرة جديدة.
16. بالانتقال إلى أسفل اللوحة ، قم بحقن كل اليرقات في هذا الصف. ثم اقلب اللوحة وحقن جميع اليرقات في الصف الآخر. < / > ملاحظه: يمكن تمييز اليرقات المحقونة أو التالفة عن طريق الخطأ عن طريق 1) الحقن في الصفار عدة مرات لإنشاء علامة حمراء أو 2) سحب اليرقة خارج الصف بالإبرة.
17. حرك الإبرة لأعلى وابتعد عن الطريق مرة أخرى. قم بالتصغير إلى تكبير أقل على المجهر. يجب أن تظل صبغة الفينول الحمراء مرئية في الدماغ الخلفي لكل يرقة.
18. أولا ، اسحب بعيدا باستخدام أداة حلقة الشعر والماصة للتخلص من أي يرقات بالحقن غير الناجحة. انقل اليرقات المتبقية إلى طبق بتري جديد عن طريق غسلها عن الطبق باستخدام E3 معقم طازج وماصة نقل.
19. كرر حسب الضرورة لرقم العينة التجريبي النهائي المطلوب.
20. اشطف اليرقات مرتين على الأقل باستخدام E3 وتأكد من الشفاء من التخدير.
21. لتحديد البقاء على قيد الحياة دون أي علاج إضافي ، باستخدام ماصة النقل ، قم بنقل اليرقات إلى صفيحة مكونة من 96 بئرا (يرقة واحدة لكل بئر) في E3.

< p class = "jove_title" >4. إنشاء أعداد الأبواغ المحقونة والقابلة للحياة

1. بعد الحقن مباشرة، باستخدام ماصة نقل، اختر عشوائيا حوالي ثمانية من اليرقات المحقونة وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.7 مل (يرقة واحدة لكل أنبوب).
2. القتل الرحيم لليرقات بطبقة التريكيين أو بوضعها عند 4 درجات مئوية لمدة 0.5-2.0 ساعة.
3. تحضير 1 مل من 1 مجم / مل أمبيسلين و 0.5 مجم / مل محاليل مضادات حيوية كاناميسين في 1x PBS المعقمة. يمكن تخزين المحلول المتبقي عند 4 درجات مئوية واستخدامه لاحقا.
   ملاحظه: يمكن تحضير محاليل مخزون الأمبيسلين عند 100 مجم / مل والكاناميسين عند 50 مجم / مل مسبقا وتعقيمها بالترشيح وتخزينها في حصص عند -20 درجة مئوية.
4. باستخدام ماصة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من أنبوب الطرد المركزي ، تاركا اليرقة وراءها ، وأضف 90 ميكرولتر من 1x PBS مع المضادات الحيوية.
   ملاحظه: تستخدم المضادات الحيوية لمنع نمو البكتيريا في ألواح GMM التي قد تتداخل مع عد مستعمرات الرشاشيات.
5. تجانس اليرقات في محلل الأنسجة عند 1,800 تذبذب / دقيقة (30 هرتز) لمدة 6 دقائق.
6. تسمية لوحات GMM (صفيحة واحدة لكل يرقات متجانسة). باستخدام موقد بنسن لخلق بيئة معقمة، قم بعمل ماصة التعليق المتجانس من أنبوب واحد إلى منتصف لوحة GMM، ثم انتشر باستخدام موزعة على شكل حرف L يمكن التخلص منها. تجنب نشر المتجانس على الحافة.
7. احتضان الصفائح رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام واحسب عدد المستعمرات المتكونة ، وحدة تشكيل المستعمرة (CFU).
8. لقياس عدد الجراثيم الحية خلال فترة الإصابة ، قطف اليرقات من الصفائح المكونة من 96 بئرا بعد 1-7 أيام من الحقن (dpi) ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي. القتل الرحيم وتجانس اليرقات لتنتشر على ألواح GMM كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.5.

فئة

5. العلاج الدوائي لليرقات المحقونة

1. بعد القسم 4 ، قسم اليرقات المحقونة المتبقية إلى طبقين مقاس 3.5 مم: أحدهما للعلاج الدوائي والآخر للمراقبة. استخدم حوالي 24 يرقة مصابة لكل حالة.
   ملاحظه: يمكن معالجة الأطباق مقاس 3.5 مم بحليب جاف خالي الدسم بنسبة 2٪ في الماء ، وشطفها ، وتجفيفها بالهواء ، وتخزينها في RT مسبقا. الطلاء بالحليب سيمنع اليرقات من الالتصاق بالبلاستيك.
2. قم بإعداد محلول الدواء المطلوب والمركبة في E3 بدون الميثيلين الأزرق في أنابيب مخروطية الشكل وفقا للتركيز النهائي المطلوب ، ثم تخلط جيدا. على سبيل المثال ، لمراقبة بقاء اليرقات المعرضة للديكساميثازون ، استخدم 24 يرقة (مكررات) للديكساميثازون و 24 للتحكم في المركبات ، مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تحضير 5 مل من محلول الدواء بالتركيز المطلوب. هنا ، تم استخدام 5 مل من 0.1٪ DMSO و 10 ميكرومتر ديكساميثازون ، وتم نقل 24 يرقة / حالة إلى ~ 200 ميكرولتر من محلول السيارة / الدواء / اليرقات.
3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من طبق واحد باستخدام ماصة نقل وأضف E3 الممزوج مسبقا الذي يحتوي على التحكم في السيارة. كرر مع E3 الممزوج مسبقا الذي يحتوي على المعالجة ذات الأهمية للطبق الآخر.
4. باستخدام ماصة ، انقل اليرقات إلى صفيحة سعة 96 بئرا (يرقة واحدة لكل بئر). مراقبة بقاء اليرقات المحقونة المعرضة للمركبة أو الدواء لمدة 7 أيام.
   ملاحظه: يمكن تطبيق الدواء فقط في يوم الإصابة والاحتفاظ به على اليرقات طوال التجربة أو يمكن تحديثه يوميا.

< p class = "jove_title" >6. التصوير اليومي لليرقات المصابة باستخدام جهاز الجرح والفخ لأسماك الزرد للنمو والتصوير (zWEDGI)

1. تأكد من معالجة اليرقات ب 100 ميكرومتر N-phenylthiourea (PTU) عند 24 حصانا في القدم لمنع التصبغ وأن PTU يتم الاحتفاظ بها على اليرقات طوال التجربة.
   ملاحظه: يمنع PTU عند 75-100 ميكرومتر تصبغ اليرقات دون أي عيوب نمو جسيمة. ومع ذلك ، يمكن أن تتداخل PTU مع بعض العمليات البيولوجية ، ويجب على الباحثين تحديد ما إذا كان الدواء قد يؤثر مسبقا على أي عمليات قيد التحقيق.
2. إصابة اليرقات المعدلة وراثيا بمجموعات الخلايا المصنفة ذات الأهمية عند 2 dpf مع جراثيم الرشاشيات المصممة للتعبير عن بروتين الفلورسنت ، كما هو موضح في القسم 3. بعد ذلك ، قم بنقل اليرقات المصابة إلى آبار من صفيحة 48 بئرا في حوالي 500 ميكرولتر / بئر من E3 بدون أزرق الميثيلين.
   ملاحظه: يتم استخدام صفيحة مكونة من 48 بئرا هنا لأنه من الأسهل نقل اليرقات من وإلى داخل وخارج أثناء التصوير اليومي المتكرر.
3. في يوم التصوير ، قم بإعداد طبقين من بتري مقاس 3.5 مم: أحدهما يحتوي على 100 ميكرومتر PTU والآخر مع E3-tricaine.
4. أضف E3-tricaine إلى غرف جهاز zWEDGI. تحت المجهر الاستريو ، قم بإزالة فقاعات الهواء من الغرف والقناة التقييدية باستخدام ماصة دقيقة P100. قم بإزالة كل E3-tricaine الزائدة ، بحيث يكون ذلك فقط في الغرف.
5. ماصة يرقة واحدة من اللوحة باستخدام ماصة نقل. إذا تم استخدام الكثير من السوائل لإزالته، فقم بوضعه في طبق مقاس 3.5 مم يحتوي على E3-PTU. بعد ذلك، قم برفع الماصة مرة أخرى، باستخدام أقل قدر ممكن من السائل، ثم انقله إلى E3-tricaine.
6. انتظر ~ 30 ثانية للتخدير ، ثم انقلها إلى غرفة التحميل الخاصة بجهاز الجرح والفخ (على سبيل المثال ، zWEDGI).
7. تحت المجهر المجسم ، ضع اليرقة. استخدم الماصة الدقيقة P100 لإزالة E3-tricaine من حجرة الجرح وإطلاقها في غرفة التحميل لتحريك ذيل اليرقة إلى قناة التقييد. تأكد من وضع اليرقة على جانبها الجانبي أو الظهري أو الظهري الجانبي بحيث يمكن تصوير الدماغ الخلفي بعدسة شيئية مقلوبة.
8. يرقة الصورة بمجهر متحد البؤر.
9. بعد التصوير ، باستخدام ماصة P100 ، حرر E3-tricaine في حجرة الجرح لدفع اليرقة من قناة التقييد إلى غرفة التحميل.
10. باستخدام ماصة النقل ، التقط اليرقة وانقلها مرة أخرى إلى طبق بتري باستخدام E3-Tricaine. باستخدام أقل قدر ممكن من السوائل ، انقله إلى طبق بتري باستخدام E3-PTU. اشطفها في PTU وانقله مرة أخرى إلى الطبق المكون من 48 بئرا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ملقط دومون # 5 شركة روبوز للأدوات الجراحية RS-5045 شبكية العدسة عالم المجهر ريترا 10 لمعايرة الإبر ، تستخدم في المجهر المجسم إعداد الحاقن الدقيق: وحدة الضغط الخلفي الأجهزة العلمية التطبيقية وحدة حماية البيانات مفتاح القدم الأجهزة العلمية التطبيقية FTSW طقم حامل الماصات الصغيرة الأجهزة العلمية التطبيقية إم بيب حاقن الضغط الأجهزة العلمية التطبيقية MPPI-3 إعداد Micromanipulator: Micromanipulator Narashige (Tritech) م -152 حامل مغناطيسي ولوحة ترايتك مينج - HBMB مجتذب إبرة أداة سوتر ف-97 مجهر مجسمة نيكون SMZ-745 محلل الأنسجة الثاني كياجين 85300 لتجانس اليرقات مادي أغاروز صياد بي بي 160-500 ملح الصوديوم أمبيسلين صياد AAJ6380706 BSA ، الكسر V VWR AAJ65855-22 كبريتات الكاناميسين صياد AAJ1792406 موزعات L صياد 14 665 230 الإبر الشعرية الدقيقة (بدون خيوط) الأجهزة الدقيقة العالمية (WPI) TW100-3 أطراف ماصة اللودر الدقيق VWR 89009-310 لتحميل الإبرة بتعليق الرشاشيات ميراكلوكوت VWR EM475855-1 ص لتصفية تعليق الرشاشيات ن-فينيلثيوريا صياد AAL0669009 لمنع التصبغ الفينول الأحمر ، محلول 1٪ صياد 57254 التريكايين (إيثيل 3-أمينوبنزوات ، ملح حمض ميثان سولفونيك) صياد AC118000500 لتخدير اليرقات توين 20 صياد بي ت 337-500 الوسائط والحلول المكونات / الوصفة وسائط E3: 60x E3 17.2 جم كلوريد الصوديوم ، 0.76 جم كلوريد كلوريد ، 2.9 جم كلوريد الكالسيوم 2 ، 4.9 جم MgSO4 · 7H2O ، إلى 1 لتر مع H2O 1x E3 16.7 مل 60x مخزون ، 430 ul 0.05 M هيدروكسيد الصوديوم ، إلى 1 لتر مع H2O (اختياري: + 3 مل 0.01٪ أزرق ميثيلين) محلول مخزون التريكايين 2 جم تريكايين ، 5 جم Na2HPO4 · 7H2O ، 4.2 مل 60X E3 ، إلى 500 مل مع H2O ، درجة الحموضة إلى 7.0-7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم أجار الحد الأدنى من الجلوكوز (GMM): أجار GMM 10 جم جلوكوز (سكر العنب) ، 50 مل 20 × أملاح نترات ، 1 مل TE ، إلى 1 لتر مع H2O ، درجة الحموضة إلى 6.5 مع هيدروكسيد الصوديوم ، + 16 جم أجار ، الأوتوكلاف 20x أملاح نترات 120 جم NaNO3 ، 10.4 جم KCl ، 10.4 جم ، MgSO4 · 7H2O ، 30.4 جم ، KH2PO4 ، إلى 1 لتر مع H2O ، الأوتوكلاف العناصر النزرة (TE) 2.20 جم ZnSO4 · 7H2O ، 1.10 جم H3BO3 ، 0.50 جم MnCl2 · 4H2O ، 0.16 جم FeSO4 · 7H2O ، 0.16 جم CoCl2 · 6H2O ، 0.16 جم CuSO4 · 5H2O ، 0.11 جم (NH4) 6Mo7O24 · 4H2O ، 5.00 جم Na2EDTA ، إلى 100 مل مع H2O ، يذوب مع التحريك طوال الليل ، الأوتوكلاف