تقنية التحويل الضوئي لاستكشاف ديناميكيات الخلايا الالتهابية في الشرانق الحشرية

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Weavers ، H. et al. ، تتبع طويل الأمد في الجسم الحي لديناميكيات الخلايا الالتهابية داخل ذبابة الفاكهة الشرانق.J. Vis. Exp. (2018)

يوضح الفيديو استخدام التحويل الضوئي لدراسة ديناميكيات الخلايا الالتهابية في ذبابة الفاكهة الشرانق. تنجذب الخلايا الدموية الخضراء إلى الظهارة المصابة ، تليها الهجرة البعيدة. يحول التحويل الضوئي بعض الخلايا الدموية من الأخضر إلى الأحمر ، مما يسهل تتبع حركتها.

Protocol

< p class = "jove_content">يتكون هذا البروتوكول من أربع خطوات متسلسلة رئيسية: (1) تحضير مخزون ذبابة الفاكهة وتحديد مراحل ذبابة الفاكهة الشرانق ، (2) تشريح العذراء وتركيبها ، (3) جرح العذراء ، (4) في الجسم الحي التصوير متحد البؤر بفاصل زمني.

< p class = "jove_title" >1. تحضير مخزون ذبابة الفاكهة وتنظيم الشرانق

1. احصل على مخزون ذبابة الفاكهة المناسب (انظر المقدمة وجدول المواد).
2. اجمع الذباب البالغ الصغير الأصحاء من النمط الجيني المناسب.
   1. اختر الذباب البالغ باستخدام وسادات غاز ثاني أكسيد الكربون لتخدير الذباب لفترة وجيزة وفرشاة رسم دقيقة لنقل الذباب من النمط الجيني أو الجنس المناسب إلى قارورة التجميع.
   2. أضف 20 أنثى عذراء و 20 ذكرا إلى كل قارورة تحتوي على وسائط طعام ذبابة قياسية (خليط دقيق الذرة والدبس والأجار ، انظر جدول المواد) مكملة بالخميرة.
3. للحصول على توليد مثالي للعذراء ، اقلب الذباب البالغ كل يوم على طعام جديد في قوارير طازجة ، مع الاحتفاظ بجميع القوارير عند 25 درجة مئوية.
   ملاحظه: إذا تم استخدام نظام تسلسل تنشيط Gal4-upstream (Gal4-UAS) لدفع التعبير الجيني الخاص بالنسب ، فيجب تنفيذ جميع الخطوات عند 25 درجة مئوية أو أعلى ، حيث أن نظام Gal4-UAS حساس لدرجة الحرارة.
4. قبل 18 ساعة من جلسة التصوير المجدولة ، حدد ما لا يقل عن 10 شرانق بيضاء متكونة حديثا (الشكل 1 أ) من القوارير (أي 0 ساعة بعد تكوين الشرانق ، APF) باستخدام ملقط أو فرشاة رسم دقيقة لإخراج الشرانق من سطح القارورة الداخلية ونقل الشرانق بعناية إلى جانب قارورة بلاستيكية فارغة نظيفة.
   ملاحظه: تزحف يرقات الطور 3 المتجولة لأعلى من وسط الطعام للخضوع للتشرنق. يمكن التعرف بسهولة على الشرانق البيضاء المتكونة حديثا لأنها تمتلك فتحات أمامية مقطوعة وثابتة (على عكس يرقات الطور 3). تتحول البشرة إلى "الشرانير" (حالة العذراء) التي تكون في البداية ناعمة وبيضاء. يجب توخي الحذر لتجنب إتلاف الشرانق ، لأن هذا يمكن أن يؤدي ليس فقط إلى استجابة التهابية غير مرغوب فيها ناتجة عن الإصابة ولكن أيضا إلى تأخير كبير في النمو.
5. عمر الشرانق المختارة إلى مرحلة النمو المناسبة (18 ساعة APF ستعطي النتائج المثلى) في القارورة عند 25 درجة مئوية.
   ملاحظه: مع تطور الشرانق ، ستصبح حالة العذراء أكثر قتامة وهشاشة بشكل تدريجي.
6. قم بإعداد الكواشف الأخرى للخطوة التالية في وقت مبكر. لصنع غراء السباعي ، امزج بطول 20 سم من الشريط الملفوف على الوجهين مع 20 مل من الهبتان في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وأغلقه بغشاء البارافين ، وصخوره في درجة حرارة الغرفة طوال الليل على المقعد.

< p class = "jove_title" >2. تحضير وتشريح ذبابة الفاكهة الشرانق

1. انقل ذبابة الفاكهة الشرانق إلى قطعة من الشريط اللاصق على الوجهين مثبتة على شريحة زجاجية. ضع الشرانق بحيث يكون الجانب البطني عالقا بإحكام على الشريط ويكون الجانب الظهري متجها لأعلى (الشكل 1 ب).
   ملاحظه: يمكن التعرف على الجزء الأمامي من الخادرة من الفتحتين التنفسيتين البارزتين من الطرف الأمامي لحالة العذراء.
2. قم بإزالة الشرانق بعناية من غلاف الشرانق الواقي تحت مجهر تشريح المجال الساطع باستخدام ملقط ومقص دقيق (الشكل 1B-D).
   1. في البداية ، قم بعمل شق في المنطقة الأمامية من الشرانق باستخدام الملقط (الشكل 1 ب). تأكد من أن حالة العذراء في هذه المنطقة مجوفة وخالية من أنسجة العذراء لأن الشرانق ستتقلص داخل الحالة أثناء تطور العذراء المبكر.
   2. بعد هذا الشق الأولي ، قم بتمزيق أو قطع علبة العذراء بعناية في اتجاه أمامي إلى خلفي باستخدام ملقط أو مقص دقيق (الشكل 1C) حتى تصبح الخادرة خالية تماما من الغلاف البني غير الشفاف الهش (الشكل 1D).
      ملاحظه: الشرانق في هذه المرحلة هشة للغاية ويجب توخي الحذر لتجنب ثقب سطح العذراء. يكون الثقب واضحا حيث يتسرب الهيموليمف بسرعة من موقع البزل. يجب التخلص من الشرانق ذات الثقوب ، مهما كانت صغيرة.
3. قم بتركيب الشرانق في طبق ذو قاع زجاجي باستخدام غراء السباعي.
   1. استخدم طرف ماصة سعة 20 مل لوضع قطرة 10 مل من غراء الهبتان المعد مسبقا (انظر القسم 1.6 أعلاه) في خط على الطبق ذو القاع الزجاجي.
   2. اترك الغراء يجف لمدة 5 ثوان قبل نقل الشرانق المقطعة بعناية إلى غراء السباعي باستخدام الملقط (الشكل 1 ه).
   3. لسهولة الجرح والتصوير ، اصطف الشرانق على التوالي ؛ يقترح ما يقرب من 5 شرانق ولكن يمكن التحكم في المزيد من خلال الخبرة><. ملاحظه: يوصى باستخدام غراء السباعي عند استخدام أنظمة التصوير العمودية ولكنه ليس ضروريا عند استخدام نظام مقلوب. إذا كان الغراء يخلق انحرافات بصرية أثناء التصوير ، فيمكن وضع الشرانق مباشرة على الغطاء بدلا من ذلك - سيكون الالتصاق الطبيعي بين أنسجة العذراء والزجاج كافيا في معظم الحالات للتصوير المستقر ، طالما يتم توخي الحذر عند تحريك طبق التصوير بين المجاهر.
4. للحصول على أفضل النتائج ، قم بتركيب الشرانق بحيث يكون الجناح مسطحا على الغطاء الزجاجي مع اتصال غالبية سطح الجناح بشكل مباشر مع الغطاء الزجاجي (الشكل 1F). قم بلف الشرانق باستخدام الملقط لتغيير موضعها لضمان تركيب الجناح بشكل صحيح.
5. لمنع جفاف العينة أثناء فترة التصوير ، أضف قطعة من ورق الترشيح الماص المنقوع في الماء المقطر إلى جانب الطبق ذو القاع الزجاجي في نهاية التركيب ، مع الحرص على عدم إزعاج الشرانق (الشكل 1 ه). غطي الطبق بغطاء. < / > ملاحظه: الشرانق جاهزة الآن للجرح والتصوير.

< p class = "jove_title" >3. الجرح الناجم عن الليزر لأجنحة ذبابة الفاكهة العذراء

1. انقل الطبق ذو القاع الزجاجي الذي يحتوي على الشرانق المثبتة إلى مجهر واسع المجال مزود بنظام استئصال بالليزر قابل للضبط.
   1. استخدم ليزر استئصال بالنيتروجين المبرد بالهواء بالأشعة فوق البنفسجية النبضي والمضبوط على 435 نانومتر - انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل ؛ يتم تحديد الطول الموجي الدقيق للضوء المستخدم للإضاءة من قبل المستخدم عبر خلية صبغ مناسبة.
2. باستخدام بصريات المجال الساطع ، اضبط عناصر التحكم في مرحلة المجهر لتحديد موقع جناح العذراء لأول خادرة يتم إصابتها (الشكل 1F).
3. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم عدسة موضوعية غمر الزيت 40X أو 63X لكل من التصوير والاستئصال بالليزر ؛ تأكد من أن سائل الغمر المستخدم (الزيت أو الجلسرين) متسق بين أنظمة الاستئصال والتصوير. اضبط المجهر للتركيز على مستوى ظهارة جناح العذراء الأقرب إلى الغطاء الزجاجي (أي التركيز على منطقة الظهارة المراد إصابتها) باستخدام مقبض التحكم في التركيز البؤري الدقيق.
4. باستخدام تعديلات مرحلة المجهر ، ضع جناح العذراء بحيث تتماشى المنطقة المراد إصابتها مباشرة مع المنطقة المستهدفة المعروفة من ليزر الاستئصال.
5. استخدم شريحة مخفف كثافة الطاقة المثبتة على المجهر لضبط مستوى طاقة ضوء الاستئصال يدويا.
   ملاحظه: يحتوي شريط تمرير المخفف على نقاط توقف وأحكام للنقر لتحديد المستوى النسبي للتوهين والسماح باستخدام الإعدادات القابلة للتكرار.
6. باستخدام التحكم اليدوي الخارجي في الزناد ، قم بتنشيط ليزر الاستئصال باستخدام نقرة واحدة قصيرة على الزناد لإحداث جرح. تحقق من ظهور فقاعة الهواء العابرة في موقع الاستئصال لأن الجرح عادة ما يكون مصحوبا بها. تحقق مما إذا كان الجرح الناجم عن الليزر ناجحا باستخدام مرشحات الفلورسنت المناسبة لتصور ظهارة العذراء. < / > ملاحظه: احرص على تجنب التعرض العرضي لأشعة الليزر لأن انعكاسات الشعاع يمكن أن تسبب أضرارا شديدة للعين أو الجلد.
7. إذا لم ينجح الجرح ، فقم بتغيير المستوى البؤري (تحريك تركيز المجهر أعلى أو أقل قليلا من المستوى البؤري الحالي) وكرر النقر الفردي على مشغل الاستئصال. بدلا من ذلك ، قم بزيادة قوة الليزر تدريجيا باستخدام شريحة المخفف حتى يتم تحقيق حجم الجرح المطلوب.
8. لتغيير معدل تكرار نبضة الليزر الاستئصال ، استخدم مقبض معدل التكرار الموجود على لوحة التحكم الخلفية (الذي يغير المعدل من أقل من 1 نبضة / ثانية إلى 60 هرتز). للحصول على الجرح الأمثل ، اضبط معدل تكرار النبضة على 40 هرتز.
9. لإنشاء جروح مختلفة الأحجام ، استخدم شريحة مخفف كثافة الطاقة لضبط مستوى طاقة ضوء الاستئصال يدويا.
10. امتنع عن إصابة جميع الشرانق المركبة واستخدم هذه الشرانق غير المفصولة كعناصر تحكم غير مصابة.
11. للحصول على نتائج متسقة، أعد محاذاة نظام الاستئصال بانتظام (باستخدام دليل التشغيل ذي الصلة). أيضا ، قم بتنظيف وإعادة تعبئة خلية مرنان الصبغة التي تتحكم في الطول الموجي لإخراج الليزر.

فئة

4. في الجسم الحي التصوير متحد البؤر بفاصل زمني

1. انقل الطبق ذو القاع الزجاجي بسرعة إلى مجهر مناسب للتصوير بفاصل زمني. < / > ملاحظه: للحصول على أفضل النتائج ، استخدم مجهر قرصي متحد البؤر أو قرص دوار عالي المواصفات مزود بكاشفات حساسة يمكنها اكتشاف كل من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والفلوروفورات mChery.
2. لتصوير جناح العذراء بأكمله ، استخدم عدسة موضوعية منخفضة التكبير (على سبيل المثال 20X) (الشكل 2 أ). لتصوير إصلاح الجرح والاستجابة الالتهابية المصاحبة له بدقة مكانية عالية ، استخدم العدسات الموضوعية الغمر بالزيت 40X (NA 1.3) أو 63X (NA 1.4) (انظر الصور التمثيلية في الشكل 2B-D).
3. افتح برنامج التقاط الصور المناسب المرتبط بالمجهر.
4. باستخدام برنامج التقاط الصور ، قم بتشغيل الليزر المناسب ، على سبيل المثال ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر لتصور GFP و mCherry fluorophores ، على التوالي (من خلال النقر في المربعات ذات الصلة) وضبط طاقة الليزر وإعدادات الكسب / الإزاحة لإعطاء إشارة فلورية كافية مع تجنب تشبع البكسل ؛ استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة (في النطاق 5 - 20٪) لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية.
5. لالتقاط كل من الظهارة المصلحة وتجنيد الخلايا الالتهابية ، اضبط المجهر لتسجيل مكدس z باستخدام مقابض ضبط التركيز الدقيقة على لوحة التحكم ؛ للحصول على أفضل النتائج ، اضبط البرنامج (باستخدام نقرات الأزرار اليدوية) لتسجيل شرائح z من خلال جناح العذراء (على الأقل كل 3 مم) ، من أعلى الظهارة المصابة إلى الفضاء خارج الخلية تحتها (تحتوي على خلايا دموية مهاجرة) لتحقيق كومة z كبيرة (في حدود 50 - 100 مم).
6. للتصوير بفاصل زمني ، قم بتسجيل مكدسات z على فترات زمنية منتظمة (كل 30 ثانية على الأقل) لمدة ساعة واحدة على الأقل بعد الجرح.
   ملاحظه: يمثل الفاصل الزمني الدقيق بين المداخن z المختارة مقايضة بين التقاط ديناميكيات الخلية سريعة التغير وتجنب التبييض الضوئي للعينات.
7. لتصوير شرانق متعددة في وقت واحد (بما في ذلك أدوات التحكم غير المصابة غير المصابة) ، استخدم مرحلة آلية (متصلة بالمجهر) وميزة اكتساب المواضع المتعددة المتوفرة داخل برنامج التصوير. قم بتعيين موضع كل خادرة يدويا داخل البرنامج باستخدام مقابض التحكم في موضع المرحلة ثم قم بتعيين حدود z-stack المناسبة (أعلى وأسفل) يدويا لكل خادرة.
8. تصور الصور ذات اللقطات المتتابعة إما أثناء التقاط الصور أو في وقت لاحق باستخدام برنامج تحليل الصور المتخصص (مثل ImageJ) باستخدام إسقاطات z-stack أو العرض ثلاثي الأبعاد. على سبيل المثال ، لمتابعة حركات الخلايا الدموية الفردية (كما في الشكل 2 ج و D) ، تتبع نوى الخلايا الدموية باستخدام المكونات الإضافية ImageJ ذات الوصول المفتوح "TrackMate" أو "التتبع اليدوي" (الطرق المنشورة في).
9. استخدم مجسات قابلة للتحويل الضوئي (مثل Kaede) لتحويل الصور بشكل انتقائي وتسمية مجموعة فرعية من الخلايا الظهارية أو المناعية أثناء التصوير.
   1. افتح الوحدات المناسبة داخل برنامج التصوير لإجراء التحويل الضوئي (مثل التعافي الفلوري بعد التبييض الضوئي (FRAP) ، واستعادة التألق بعد وحدة التبييض الضوئي) وتنشيط ليزر 405 نانومتر (بالنقر فوق مربع البرنامج ذي الصلة).
   2. حدد الخلايا المراد تحويلها ضوئيا داخل برنامج FRAP باستخدام أداة التحديد المربعة أو الدائرية أو اليدوية. ضمن برنامج FRAP ، قم بتعيين المسار الزمني لتحويل الصور (التبييض) إلى تكرار / إطار واحد واضبط ليزر 405 نانومتر على طاقة ليزر 20٪. انقر يدويا على بدء التجربة لإجراء تحويل الصور.
   3. اخرج من وحدة FRAP (انقر فوق إغلاق) وارجع إلى شاشة التصوير الأصلية داخل البرنامج ؛ استخدم ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر لتصوير سلوك الخلايا المحولة ضوئيا وغير المحولة ضوئيا عن طريق إعداد z-stack وتسجيل الفاصل الزمني على النحو الوارد أعلاه.
      ملاحظه: تظل المجسات المحولة ضوئيا مستقرة لعدة ساعات بعد التحويل الضوئي الأولي ، مما يتيح متابعة سلوك الخلايا المحولة ضوئيا بمرور الوقت (لمدة 5 ساعات على الأقل). على سبيل المثال ، يمكن تحويل الخلايا الالتهابية في الجرح بشكل انتقائي (الشكل 2F) واتباع سلوكها أثناء حلها من موقع الإصابة (الشكل 2G و H).

Results

الشكل 1: ذبابة الفاكهة خادرة تحضير الجرح والتصوير الحي. (أ) ذبابة الفاكهة قبل الشرانق البيضاء التي تم جمعها في 0 ساعة APF ، مع الإشارة إلى النهاية الأمامية بواسطة زوائد التنفس المقلوبة (الفتحات التنفسية). (ب) بعد رفع شرانق APF البيضاء 0h لمدة 18 ساعة عند 25 درجة مئوية ، تظهر الشرانق باللون البني. يجب أن يبدأ تشريح حالة العذراء في المنطقة الأمامية (ا...

Materials