مقالة منهجية

اختبار Opsono-Paledence لتقييم Opsonization للبكتيريا المغلفة بواسطة الأجسام المضادة للكبسولة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Chua، J.، et al. opsono-adherence asssay لتقييم الأجسام المضادة الوظيفية في تطوير اللقاح ضد عصيات الجمرة الخبيثة ومسببات الأمراض المغلفة الأخرى. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو مقايسة الالتزام opsono لفحص التفاعل بين البكتيريا المضادة للخلايا المناعية. يتم تحضين البكتيريا ذات العلامات الفلورية ، المعالجة بمصل الاختبار الذي يحتوي على أجسام مضادة مضادة للكبسولات ، بالضامة. بعد تلطيخ البلاعم بالمضان ، لوحظت البكتيريا المرفقة على سطح البلاعم تحت المجهر للتصور.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< ص الفئة = "jove_title" >1. الثقافة البكتيرية والمستحضرات

< p class = "jove_content" >ملاحظة: الأنواع البكتيرية المستخدمة في هذا البروتوكول هي سلالة خبيثة مغلفة ، B. anthracis Ames. تتطلب جميع عمليات التلاعب بهذا النوع تصاريح مناسبة للسلامة البيولوجية والأمن ويجب إجراؤها في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية أو الثالثة الموجودة في مختبر BSL-3. اتباع إجراءات التشغيل المؤسسية لعمل BSL-3 واستخدام معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع البكتيريا.

  1. تحضير مرق تسريب قلب الدماغ (BHI) عن طريق إذابة 37 جم من مسحوق BHI في 1 لتر من الماء والتعقيم بالحرارة عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. تحضير محلول بيكربونات الصوديوم 8٪ في الماء وتعقيمه باستخدام حقنة مرشح 0.20 ميكرومتر. يخزن المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم في غضون 1 يوم.
  3. اخلطي 8 جم من مرق المغذيات و 3 جم من مستخلص الخميرة و 15 جم أجار في 1 لتر من الماء لتحضير أطباق أجار NBY. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تصب في أطباق بتري وتترك لتتجمد. تخزين الأطباق في 4 درجات مئوية
    ملاحظه: يمكن تصنيع ألواح أجار NBY مع أو بدون بيكربونات الصوديوم. تؤدي إضافة بيكربونات الصوديوم إلى ألواح المرق والأجار إلى نمو مستعمرات الغشاء المخاطي المكونة من عصيات مغلفة. التركيز النهائي لبيكربونات الصوديوم في كل من الوسائط السائلة والصلبة هو 0.8٪.
  4. تحضير مرق الاستزراع ل B. anthracis عن طريق خلط 50٪ مرق BHI المعقم ، و 40٪ FBS ، و 10٪ محلول بيكربونات الصوديوم (v / v).
    ملاحظه: تمت صياغة هذا المرق لإنتاج سلاسل قصيرة من العصيات المغلفة.
  5. قم بإعداد صفيحة رئيسية من B. anthracis عن طريق خطها للعزل على طبق أجار NBY من مخزون بوغ قبل يوم واحد من زراعته في المرق. احتضان عند 37 درجة مئوية.
  6. تلقيح 30 مل من مرق الاستزراع في قارورة ذات فتحات تهوية سعة 250 مل مع عدة مستعمرات من B. anthracis.
    ملاحظه: هناك حاجة إلى نسبة محددة من الحجم إلى السطح من المرق ، كما هو محدد هنا ، لإنتاج العصيات المغلفة إلى أقصى حد.
  7. رج مزرعة المرق عند 125 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية مع 20٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة لمدة 18-24 ساعة < / > ملاحظه: قد يؤدي نمو B. anthracis في درجات حرارة أعلى من 37 درجة مئوية إلى تثبيط إنتاج الكبسولات.
  8. استخدم التلوين السالب بالحبر الهندي لضمان التغليف الكافي وأن تكون العصيات في سلاسل قصيرة (1-5 عصيات / سلسلة) قبل التثبيت (انظر القسم 2).
  9. لتحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من المزرعة بشكل متسلسل 1:10 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وتخفيفات زراعة الألواح على ألواح أجار دم الأغنام. احتضان لمدة 12-18 ساعة عند 37 درجة مئوية. عد CFUs وحدد عدد البكتيريا لكل مل من المزرعة.
    ملاحظه: يمكن أيضا إجراء العد باستخدام مقياس الدم تحت المجهر بمجرد إصلاح البكتيريا. ومع ذلك ، لا ينصح بذلك لأنه يصعب رؤية العصيات في ظل التكبير المنخفض.
  10. أضف 16٪ بارافورمالدهيد (PF) إلى الحجم الكامل للزراعة البكتيرية بتركيز نهائي قدره 4٪ PF لإصلاح العصيات. حرك ببطء على شاكر في درجة الحرارة المحيطة لمدة 7 أيام.
    ملاحظه: تعتمد سبعة أيام من الحضانة في 4٪ PF على إجراء التشغيل المؤسسي القياسي لمعهد البحوث الطبية للأمراض المعدية بالجيش الأمريكي (USAMRIID) لإصلاح العصيات الخضرية.
  11. لإزالة المثبت واختبار العقم ، اغسل ثلاث مرات 4 مل (حجم 10٪) من المعلق البكتيري الثابت في أنبوب مخروطي سعة 50 مل عن طريق الطرد المركزي عند ≥3000 × جم لمدة 45 دقيقة وباستخدام 30 مل / غسل مع PBS. قم بتخزين العينة المتبقية في 4٪ PF عند 4 درجات مئوية
    ملاحظه: بعد التكوير ، تكون الحبيبات البكتيرية رقيقا بسبب وجود كبسولة. احرص على عدم إزعاج الحبيبات أثناء الغسيل. من الضروري إزالة جميع المثبتات حتى لا تتداخل مع اختبار الجدوى. إذا لزم الأمر ، قم بزيادة عدد الغسل.
  12. لاختبار الجدوى ، قم بتلقيح 40 مل من وسط نمو البكتيريا (مثل مرق BHI) ب 4 مل من المعلق المغسول (≤ 10٪ من حجم المرق) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. تحقق من الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر قبل وبعد 7 أيام لقياس التعكر.
  13. بعد 7 أيام من الحضانة في ثقافة المرق ، ضعي ≥100 ميكرولتر من المرق على طبق أجار واحتضنها لمدة 7 أيام أخرى. إذا لم تظهر أي زيادة في التعكر ولا يوجد نمو على الصفائح ، فإن المزرعة الأصلية تعتبر معقمة ويمكن نقلها إلى مختبر BSL-2.
    ملاحظة:     ينص برنامج الوكيل الفيدرالي المختار على أن B. الجمرة الخبيثة المعطلة لا يمكن نقلها إلا من مختبرات BSL-3 بعد إثبات العقم الكامل للعينة. يتكون اختبار الجدوى ل B. anthracis المعطلة من زراعة 10٪ من العينة في المرق لمدة 7 أيام متبوعا بالزراعت على وسط صلب لمدة 7 أيام أخرى. اتبع الإرشادات المؤسسية للحصول على الموافقة على النقل بمجرد إثبات العقم.         
< p class = "jove_title" >2. تلطيخ سلبي وفحص مجهري ضوئي لمراقبة التغليف وسلاسل العصيات

  1. امزج معلق بكتيري سعة 5 ميكرولتر مع 2 ميكرولتر من الحبر الهندي على شريحة مجهرية. ضع غطاء زجاجي بسمك 1 أو 1.5 ميكرومتر أعلى التعليق دون تكوين فقاعات.
    ملاحظه: يمكن استخدام طلاء الأظافر لإغلاق زجاج الغطاء على الشريحة.
  2. راقب التعليق البكتيري باستخدام عدسة موضوعية زيتية من 40x إلى 100x على المجهر الضوئي. تأكد من تغليف العصيات من خلال مراقبة منطقة الخلوص (الكبسولة باستثناء الحبر الهندي) المحيطة بكل بكتيريا وأن سلاسل العصيات قصيرة.
فئة

3. تصنيف FITC للبكتيريا

  1. قم بإذابة الفلورسينات إيزوثيوسيانات (FITC) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 2 مجم / مل.
  2. قياس حجم مخزون البكتيريا المعطل.
  3. اغسل المرق 3x في PBS لإزالة المثبت.
  4. أضف محلول FITC بتركيز نهائي قدره 75 ميكروغرام / مل. حرك الخليط ببطء لمدة 18-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  5. اغسل البكتيريا ثلاث مرات عن طريق التكوير عند ≥3000 × جم ، 45 دقيقة ، واستخدام 30 مل PBS / غسل لإزالة FITC الزائد. تأكد من عدم إزعاج الحبيبات الرقيقة أثناء الغسيل. أعد تعليق العصيات في PBS بنفس حجم البدء.
    6. قم
  6. بتخزين العصيات في أنابيب دقيقة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تجميد / تذوب العصيات عدة مرات لأن العصيات قد تفقد كبسولتها.
< p class = "jove_title" >4. التبصر البكتيري

  1. تعطل الحرارة حجما صغيرا من مصل الاختبار (من الرئيسيات غير البشرية ، NHPs) عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كتلة حرارية.
  2. قم بإذابة وغسل البكتيريا التي تحمل علامة FITC باستخدام PBS 2x عن طريق التكوير عند 15000 × جم لمدة 3-5 دقائق.
  3. في صفيحة سفلية مستديرة مكونة من 96 بئر (لوحة # 2) ، قم بتخفيف مصل الاختبار بشكل متسلسل في وسط الخلية. في صفيحة سفلية مستديرة أخرى مكونة من 96 بئرا (لوحة # 3) ، أضف 10 ميكرولتر من مصل الاختبار المخفف في كل بئر.
    ملاحظه: في كل لوحة ، تم تضمين PBS وأمصال الطبيعية بدلا من مصل الاختبار المخفف كضوابط سلبية. اخترنا أيضا مصل اختبار واحد كعنصر تحكم إيجابي لإنشاء منحنى قياسي لتطبيع جميع المقايسات التي يتم إجراؤها في أيام مختلفة. تم اختيار مصل اختبار التحكم الإيجابي بشكل تعسفي لأنه كان وفيرا.
  4. إلى الطبق # 3 ، أضف 10 ميكرولتر من مكمل الأرانب الصغيرة المعاد تكوينه حديثا.
    ملاحظه: بمجرد إعادة تكوينه ، تخلص من مكمل الأرانب الصغيرة المتبقي ؛ لا تعيد التجميد وتذوب.
  5. إلى اللوحة # 3 ، أضف الحجم المناسب من العصيات المسماة ب FITC لتعدد العدوى 1:20. على سبيل المثال، أضف وحدة التخزين التي تحتوي على 5 × 104 × 20 عصية ل 5 × 104 خلايا. قم بتعبئة كل بئر في اللوحة # 3 بالحجم المناسب لوسط الخلية ليصبح الإجمالي 105 ميكرولتر < br / > ملاحظه: تتلقى اللوحة # 1 ، التي تحتوي على خلايا ، 100 ميكرولتر من البكتيريا المضادة مع 5 ميكرولتر المتبقية كحجم الفراغ. اختبرنا كل تخفيف من مصل الاختبار في نسختين.
  6. احتضان اللوحة # 3 عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع الرطوبة لمعالجة العصيات.

5. فحص الالتزام ووضع العلامات الفلورية لخلايا الثدييات

  1. حافظ على جميع الكواشف عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. ضع اللوحة # 1 ، التي تحتوي على خلايا ملتصقة ، على كتلة حرارية 37 درجة مئوية.
  3. استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة الوسط المستهلك من الآبار واستبداله بسرعة ب 100 ميكرولتر من البكتيريا المضادة للضلاميرات من اللوحة #3. تأكد من عدم وجود فقاعات في الآبار أثناء سحب العينات. احتضان اللوحة # 1 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 والرطوبة لمدة 30 دقيقة للالتصاق.
  4. اغسل كل بئر 5 مرات باستخدام 150 ميكرولتر PBS فوق كتلة حرارية 37 درجة مئوية لإزالة العصيات غير المرفقة.
    ملاحظه: يجب توخي الحذر لضمان عدم تشتت الخلايا عن طريق الخطأ أثناء الغسيل.
  5. قم بتخفيف 16٪ PF باستخدام PBS 1: 4 لعمل 4٪ PF. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ PF لمدة ساعة واحدة عن طريق إضافة 150 ميكرولتر إلى كل بئر. اغسل الخلايا 2x باستخدام PBS.
  6. امزج 2 ميكرولتر HCS (فحص عالي المحتوى) صبغة الخلايا البرتقالية في 10 مل PBS. أضف 150 ميكرولتر من محلول التلوين هذا إلى الخلايا الثابتة واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة.
  7. اغسل الآبار 2x باستخدام PBS.
  8. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الفحص المجهري.
< p class = "jove_title" >6. الفحص المجهري

ملاحظة: بشكل عام ، سيسهل المجهر الفلوري الآلي عالي الإنتاجية التصوير ل OAA. في حالة عدم توفر نظام آلي ، يمكن التقاط صور الفلورسنت للعصيات الملتصقة يدويا. في هذه الدراسة ، تم تصوير العصيات الملتصقة والطبقات الأحادية الخلوية باستخدام نظام الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر Zeiss 700 مع معدات متخصصة. كان نظامنا يتألف من Zeiss Axio Observer Z1 المجهر المقلوب المجهز بمرحلة آلية ، ووحدة التركيز المحدد ، وهدف 40 × NA 0.6 ، وكاميرا Axio Cam HRc وبرنامج Zen 2012 (الإصدار الأزرق). الصور التي تم الحصول عليها هي صور واسعة النطاق وليست صورا متحدة البؤر. الغرض من البروتوكول التالي هو إعداد مجهر أساسي ينطبق على مجموعة متنوعة من أنظمة الفحص المجهري الآلي.

  1. احتضن اللوحة # 1 في درجة الحرارة المحيطة لمدة 30 دقيقة. قم بتشغيل المجهر والمعدات ذات الصلة.
    ملاحظه: يمنع التأقلم في درجة الحرارة المحيطة التكثيف من التكون على اللوح الزجاجي أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يمنع إلغاء التركيز البؤري بسبب التغيرات في درجات الحرارة.
  2. ضع اللوحة على المسرح وركز على الخلايا باستخدام مجال ساطع أو تباين طور.
  3. حدد تنسيق البئر 96 كإعداد اللوحة. حدد إعدادات القناة.
    ملاحظه: يبلغ الطول الموجي للإثارة والانبعاث في FITC 495/519 نانومتر. بقع الخلايا البرتقالية HCS هي 556 و 572 نانومتر. يمكن استخدام الفلوروفورات الأخرى اعتمادا على المرشحات المتوفرة على المجهر.
  4. حدد الإعداد إلى وضع التجانب. حدد عدد الصور التي سيتم الحصول عليها.
    ملاحظه: تسمح وظيفة التجانب بالتقاط مواقع متعددة في بئر عينة ويمكن ضبطها للحصول على صورة بتنسيق تجانب أو عشوائي. قمنا بتصوير 10 مناطق عشوائية لكل بئر.
  5. قم بتغيير وضع الاستحواذ إلى "أبيض وأسود" أو "أحادي اللون" وتجميع ≥ 2x2.
    ملاحظه: سيؤدي تعيين التجميع من 1 × 1 إلى 2 × 2 أو 4 × 4 إلى زيادة سرعة الفحص المجهري ولكنه سيؤدي أيضا إلى انخفاض دقة الصورة. بالنسبة إلى OAA ، يكفي استخدام هذه الإعدادات حيث يعدد الاختبار كلا من البلاعم والبكتيريا الملتصقة.
  6. قم بتشغيل التركيز البؤري التلقائي أو وحدة التركيز البؤري. حدد عدد المرات التي سيتم فيها تنفيذ وظيفة التركيز البؤري التلقائي. قم بتشغيل وظيفة مكدس Z، إن وجدت. حدد عدد مداخن Z التي ستلتقط سمك الخلية أحادية الطبقة والعصيات الملتصقة.
    ملاحظه: سيؤدي عدد مكدسات Z المختارة إلى زيادة وقت الفحص المجهري ولكنه سيضمن التقاط صورة ذات التركيز الصحيح في كل مكدس Z.
  7. قم بتعيين مجلد ملف لحفظ الصور فيه. قم بتشغيل برنامج التصوير الآلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرشح حقنة 0.20 ميكرومتر (25 مم ، السليلوز المتجدد) كورنينج ، كورنينج ، نيويورك 431222 حقنة 10 مل (طرف Luer-Lock) BD ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي 302995 15 ميكرومتر 96 لوحة سوداء جيدا (لوحة # 1 للتصوير) في المختبر العلمي ، سانيفيل ، كاليفورنيا ص 96-1-ن 16٪ بارافورمالدهيد علم المجهر الإلكتروني ، هاتفيلد ، بنسلفانيا 15710 [م] 75 سم مربع قارورة معالجة بزراعة الأنسجة كورنينج ، كورنينج ، نيويورك 430641 أجار (مسحوق) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري أ 1296 مكمل الأرنب الصغير مختبرات سيدارلين ، برلنغتون ، نورث كارولاينا CL3441 مستخلص خميرة باكتو دينار بحريني ، سباركس ، دكتوراه في الطب هاتف: 288620 تسريب قلب الدماغ تكبير المؤشرات (BHI) دينار بحريني ، سباركس ، دكتوراه في الطب 211059 لوحات Blood Agar (TSA مع دم الأغنام) ريميل ، لينيكسا ، كانساس R01198 مكشطة الخلية سارستيدت ، نيوتن ، نورث كارولاينا 83.183 دولار ألواح زراعة خلايا البئر Costar 96 (الألواح # 2 و 3 للتخفيفات) كورنينج ، كورنينج ، نيويورك 3596 ريال غطاء زجاجي علم المجهر الإلكتروني ، هاتفيلد ، بنسلفانيا 72200-10 مرق المغذيات Difco دينار بحريني ، سباركس ، دكتوراه في الطب هاتف: 234000 وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، نسبة عالية من الجلوكوز جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس 11965-092 يحتوي على 4500 مجم / لتر جلوكوز ، 4 ملي مولار ل-جلوتامين ، فينول أحمر نظام التصوير التلقائي للخلايا EVOS FL (المجهر الفلوري) تقنيات الحياة ، ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس AMAFD1000 مصل الأبقار الجنينية Hyclone ، GE Healthcare Life Sciences ، جنوب لوجان ، يوتا SH30071.03 لا تتعرض جاما للإشعاع ، ولا يتم تعطيل الحرارة فلورسينات إيزوثيوسيانات Invitrogen ، ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس F143 قناع خلية HCS وصمة عار الخلية البرتقالية Invitrogen ، ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس H32713 مقياس الدم (تحسين نيوباور ) هوسر ساينتفيك ، هورشام ، بنسلفانيا 3900 دولار حل الحبر الهندي دينار بحريني ، سباركس ، دكتوراه في الطب 261194 L- الجلوتامين (200 ملم) جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ماساتشوستس 25030081 وسط مكمل غذائي مع 2 ملي إل جلوتامين إضافي نيكون Eclipse TE2000-U (المجهر المركب المقلوب) نيكون إنسترومنتس، ميلفيل، نيويورك TE2000 PBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم لونزا ، ووكرسفيل ، دكتوراه في الطب 17-516 فهرنهايت محلول البنسلين والستربتومايسين ، 100x Hyclone ، GE Healthcare Life Sciences ، جنوب لوجان ، يوتا SV30010 أطباق بتري (100 × 15 مم) فالكون ، كورنينج ، دورهام ، نورث كارولاينا 351029 للوحات أجار خط خلايا البلاعم RAW 264.7 (Tib47) ATCC ، ماناساس ، فيرجينيا ATCC TIB-71 الشرائح VWR ، رادنور ، بنسلفانيا 16004-422 بيكربونات الصوديوم سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري الطراز S5761 محلول تريبان الأزرق (0.4٪) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري تي 8154 الفحص المجهري بالليزر Zeiss 700 (المجهر متحد البؤر) كارل زايس التصوير المصغر ، ثورنود ، نيويورك 4.109 إ + 15

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fc

مقالات ذات صلة