تقييم تنشيط الخلايا التائية الخاضعة للرقابة باستخدام معقد التوافق النسيجي الكبير الببتيد القابل للتنشيط الضوئي

الملخص

المصدر: Sanchez ، E. ، et al. التحكم المكاني والزماني في تنشيط الخلايا التائية باستخدام ناهض قابل للتنشيط الضوئي. J. Vis. Exp. (134) ، (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة لفك مركب التوافق النسيجي الرئيسي للببتيد القابل للتنشيط الضوئي باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. تكشف عملية الإزالة عن تسلسل الببتيد الأصلي ، مما يتيح تنشيطا دقيقا للخلايا التائية.

البروتوكول

فئة

1. تحضير الأسطح الزجاجية المنبهة

1. قم بتغطية زجاج الغرف المكونة من ثماني آبار بالبولي إل ليسين البيوتينيل (Bio-PLL) المخفف 1: 500 في الماء المقطر منزوع الأيونات (ddH₂O). احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. يغسل ب H₂O.
3. يجف لمدة 2 ساعة في RT.
4. قم بحظر الأسطح المطلية ب Bio-PLL مع عازلة مانعة (محلول ملحي مخزن ب HEPES [10 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.4 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم] ، مع 2٪ BSA) لمدة 30 دقيقة عند RT.
   1. قم بإذابة 5 ملغ من هيدروبروميد بولي إل ليسين في 1 مل من 10 ملي NaPO4 ، درجة الحموضة 8.5.
   2. أضف 125 ميكرولتر (0.55 مجم) من NHS-biotin (من مخزون 100 مجم / مل في DMSO) وتحقق من درجة الحموضة للتفاعل. إذا كان الرقم الهيدروجيني أقل من 8.5 ، أضف 2 ميكرولتر من 4 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم لرفعه إلى ما بين الرقم الهيدروجيني 8.5 و 9.5.
   3. دوامة لمدة 30 دقيقة.
   4. قم بإخماد التفاعل ب 50 ميكرولتر من 100 ملي مولار جلايسين مذاب في 20 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 8.0.
   5. تدور بكامل طاقتها لمدة 10 دقائق وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
      ملاحظة: تتم مقارنة جودة Bio-PLL عادة بالمستحضرات السابقة عن طريق طلاء التخفيفات التسلسلية ذات الطي المزدوج للمادة على صفيحة ELISA المكونة من 96 بئرا وتحديد محتوى البيوتين بعد الحضانة باستخدام الستربتافيدين المقترن بالفوسفاتيز القلوي.
5. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر. لا تدع الآبار تجف. أضف الستربتافيدين (100 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت للحظر). احتضان لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
6. يغسل في HBS. ملء وعكس الآبار المنزلقة للغرفة 4-5 مرات ، وإزالة HBS من الآبار. لا تدع الآبار تجف.
7. أضف روابط pMHC الحيوية وجزيئات الالتصاق إلى السطح.
   ملاحظه: يمكن وضع MCC و OVA في قفص ضوئي عن طريق إضافة مجموعات الحماية القائمة على أورثو نيتروبنزيل (على سبيل المثال ، نيتروفينيل إيثيل (NPE) أو نيتروفيراتريلوكسي كربونيل (NVOC)) إلى المجموعة الأمينية ε من اللايسينات الرئيسية (K12 في MCC ، K7 في OVA). يمكن الحصول على MCC و OVA في قفص ضوئي من البائعين التجاريين. بعد إعادة التكوين في عازلة مائية ، يتم إعادة طيها في I-E^k و H2-K^b المعبر عنها بكتيريا باستخدام الأساليب المعمول بها.
8. التحقق من صحة ببتيد MCC أو OVA القابل للتنشيط الضوئي
   1. ببتيدات محمية ب NVOC عن طريق الأشعة فوق البنفسجية المشعة بمصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة (انظر جدول المواد) لمدة 20 دقيقة في RT.
   2. نبض 1.0 × 10⁵ APCs مع 1 ميكرومتر من الببتيد غير المحفز (تحكم سلبي ، على سبيل المثال Hb) ، وببتيد غير قابل للتنشيط الضوئي ، وببتيد قابل للتنشيط الضوئي مشع ، وببتيد ناهض (تحكم إيجابي ، على سبيل المثال ، MCC) لمدة ساعة واحدة إلى بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
   3. لتحفيز الخلايا التائية التي تعبر عن 5C. C7 / 2B4 / و TCR ، استخدم خلايا CH12 أو CH27 B. لتحفيز الخلايا التائية OT1 ، استخدم خلايا الورم الزعتري RMA-s أو EL4.
   4. امزج ناقلات الجنود المدرعة النبضية مع عدد متساو من الخلايا التائية في ألواح سفلية مستديرة 96 بئرا بحجم نهائي قدره 200 ميكرولتر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة.
   5. استرجع المواد الطافية من كل بئر وقم بتحليل IL-2 بواسطة ELISA باستخدام الكشف اللوني عن الستربتافيدين والفجل الحار بيروكسيداز.
      ملاحظة: يوصى بشدة بتأكيد حالة الأقفاص لجميع الببتيدات عن طريق قياس الطيف الكتلي بالرش الكهربائي قبل إعادة طيها إلى مجمعات معقد التوافق النسيجي الكبير.
9. قم بطي وتنقية معقد التوافق النسيجي الكبير لتقليل التعرض للضوء. على سبيل المثال ، قم بلف تفاعلات الطي بورق الألمنيوم وقم بإجراء كروماتوغرافيا ترشيح الهلام مع إيقاف تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
   ملاحظه: لقد وجد أن MCC- I-E^k و OVA- H2-K^القابل للتنشيط الضوئي يحفزان تنشيط الخلايا التائية المستقلة عن الأشعة فوق البنفسجية بكثافة عالية ، ربما بسبب القفص الوظيفي غير المكتمل. ومن ثم ، يتم تخفيف معقد التوافق النسيجي الكبير القابل للتنشيط الضوئي إلى زيادة 10-30 ضعفا من pMHC غير التحفزي (على سبيل المثال I-E ^k الذي يحتوي على ببتيد الهيموجلوبين (Hb)) أثناء خطوة الشلل. هذا يعزز نسبة الإشارة إلى الضوضاء لتجربة التصوير اللاحقة.
10. لتنشيط الخلايا التائية CD4 ⁺ ، استخدم بشكل جماعي مزيجا من Hb-I-Ek الحيوي (3 ميكروغرام / مل) ، MCC- I-E^k القابل للتنشيط الضوئي الحيوي (0.1 ميكروغرام / مل) ، والأجسام المضادة البيوتينيل ضد الفئة الأولى MHC H2-K^k (0.5 ميكروغرام / مل). يشجع الجسم المضاد ل H2-K^k على 5 درجة مئوية. خلايا C7 / 2B4 / AND T ، التي تعبر عن H2-K^k ، لتنتشر على سطح الزجاج دون الخضوع للتنشيط.
11. بالنسبة للخلايا التائية CD8 ⁺ ، استخدم مزيجا من H2-Db البيوتينيل الذي يحمل الببتيد KAVYDFATL (1 ميكروغرام / مل) ، OVA-H2-Kb القابل للتنشيط الضوئي الحيوي (0.1 ميكروغرام / مل) ، والمجال خارج الخلية لجزيء الالتصاق ICAM-1 (2 ميكروغرام / مل الناتج عن زراعة خلايا الحشرات). يشجع ICAM-1 على تكوين اتصال وثيق عن طريق إشراك الإنتجرين LFA1 على سطح الخلية التائية.
12. ضع جميع مخاليط البروتين في مخزن مؤقت مانع ، متبوعا بحضانة لمدة ساعة واحدة عند RT أو ساعتين على الأقل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظه: الكثافة الجزيئية على الأسطح من هذا النوع لتكون ~ 8000 لكل ميكرومتر 2 تم تحديدها مسبقا. بالنظر إلى أن pMHC القابل للتنشيط الضوئي يمثل ~ 1/30 من البروتين الحيوي على السطح ، فإن كثافته ستكون ~ 267 جزيئا لكل ميكرومتر مربع ، قبل التفكيك.
13. يغسل كما في الخطوة 1.6 ويترك في HBS حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
14. أضف 200,000 خلية CD4 ⁺ أو CD8 ⁺ T تعبر عن TCR المناسب في كل بئر واسمح للخلايا بالالتصاق عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بمجرد أن تلتصق الخلايا بالسطح وتنتشر عليه ، فإنها تكون جاهزة للتنشيط الضوئي والتصوير.
    ملاحظه: تم وصف نقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية المستجيبة مع مجسات التصوير الفلورية بالتفصيل في مكان آخر. يمكن أيضا دراسة إشارات الكالسيوم باستخدام الخلايا التائية غير المنقولة المحملة بصبغة Fluo-46 الحساسة للكالسيوم. لا ينصح باستخدام صبغة القياس النسبي Fura-2 لأنها تتطلب إثارة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ، مما يؤدي أيضا إلى إزالة معقد التوافق النسبي الكبير القابل للتنشيط الضوئي.

2. الحصول على الصور

1. استخدم مجهر TIRF مقلوب مزود بعدسة موضوعية 150X متوافقة مع الأشعة فوق البنفسجية للحصول على الصور. تشع الأشعة فوق البنفسجية المناطق التي يحددها المستعمل باستخدام نظام غشاء رقمي متصل بمصباح زئبقي بقدرة 100 واط (HBO). قم بتوجيه ضوء الأشعة فوق البنفسجية من هذا المصباح إلى العينة باستخدام مرآة تمرير بطول 400 نانومتر.
2. استخدم برنامج تحليل الصور للتنشيط الضوئي المترجم والحصول على اللقطات المتتابعة. في معظم التجارب ، راقب المجسات في كل من القناتين الخضراء والحمراء باستخدام ليزر الإثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر ، على التوالي. يتم توجيه ضوء الليزر إلى العينة باستخدام مرآة ثنائية اللون مزدوجة النطاق تنقل أيضا في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (لتمكين التفكيك). يرجى الاطلاع على جدول المواد والشكل 1 للحصول على معلومات إضافية حول تكوين المجهر.
3. بعد تركيب شريحة الغرفة التي تحتوي على الخلايا التائية ، اضبط الإعدادات للحصول على إضاءة TIRF أو إضاءة التألق ، حسب الضرورة. في الوضع المباشر ، حدد مجالا من الخلايا التي تعبر عن مسبار (مسبارات) الفلورسنت ذات الأهمية. إنشاء مناطق على نطاق ميكرون للتنشيط الضوئي أسفل الخلايا الفردية باستخدام التحكم في البرنامج.
4. ابدأ الاستحواذ على اللقطات المتتابعة. عادة ، يتم الحصول على 80 نقطة زمنية ، مع فاصل زمني قدره 5 ثوان بين كل نقطة زمنية. هذا يترك أكثر من وقت كاف للتعريضات المتسلسلة 488 نانومتر و 563 نانومتر ، في حالة التجارب ذات الألوان المزدوجة.
5. بعد 10 نقاط زمنية ، قم بتنشيط المناطق المحددة عن طريق فتح غالق الحجاب الحاجز الرقمي لمدة 1 - 1.5 ثانية.
6. بعد اكتمال الفاصل الزمني، حدد حقلا جديدا من الخلايا وكرر العملية.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تكوين المجهر للتنشيط الضوئي وتصوير TIRF.

يتم استخدام < p class = "jove_content" >488 نانومتر و 561 نانومتر للتصوير TIRF والتصوير اللامع للمجسات الخضراء والحمراء ، على التوالي. وتؤخذ الأشعة فوق البنفسجية للتنشيط الضوئي من مصباح زئبقي متصل بنظام غشاء رقمي قادر على إضاءة مناطق صغيرة يحددها المستخدم. ينعكس الضوء من مصباح الزئبق / الحجاب الحاجز على العينة بواسطة مرآة طويلة ال...

المواد