تقييم طوبولوجيا المشبك المناعي من خلال تصوير الخلايا الحية

الملخص

المصدر: Martinelli، R. et al. ، نموذج خلية مستوية بطانية لتصوير ديناميكيات المشبك المناعي.J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا الحية لطوبولوجيا المشبك المناعي ، والتحقيق في التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية التائية والخلايا الظهارية التي تحمل مستضدات الفلورسنت. يكشف الفحص المجهري الفلوري عن إزاحة السيتوبلازم الأحمر وحلقات الغشاء الأصفر في الخلايا البطانية ، مما يشير إلى تكوين نقاط الاشتباك العصبي المناعية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا التائية / الذاكرة البشرية CD4 ⁺ Th1

1. ضع عاصبة على ذراع المتبرع ، وامسح الوريد بالكحول ، وأدخل إبرة. اسحب 15 مل من الدم ببطء إلى مكنسة كهربائية باستخدام EDTA كمضاد للتخثر. عندما يتم سحب الدم ، قم بفك العاصبة قبل إزالة الإبرة. اضغط على الفور على الجرح بشاش معقم عند إزالة الإبرة.
2. نقل الدم إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف RPMI-1640 في RT بتخفيف 1: 1 (الحجم النهائي 30 مل). قم بتراكب الدم المخفف بعناية على أنبوبين سعة 50 مل يحتويان على 15 مل من وسط عزل الخلايا الليمفاوية المفلترة مسبقا مثل Ficoll-Paque في RT.
قم
3. بالطرد المركزي التدرج عند RT لمدة 30 دقيقة عند 1,200 × جم في دوار دلو متأرجح. أثناء الطرد المركزي تحضير وسط الخلايا التائية (500 مل من RPMI-1640 ، 50 مل FCS ، 5 مل بنسلين / ستربتومايسين).
4. عند إزالة أنبوب 50 مل من جهاز الطرد المركزي ، لاحظ أربع طبقات: حبيبات من خلايا الدم الحمراء في الأسفل ، والبكاء ، وطبقة من الخلايا التي تحتوي على خلايا الدم البيضاء (بما في ذلك الخلايا الليمفاوية) ، والبلازما. قم بإزالة طبقة خلايا الدم البيضاء بعناية باستخدام ماصة باستور وانقلها إلى أنبوب فالكون سعة 50 مل.
5. اغسل طبقة خلايا الدم البيضاء عن طريق إضافة RT RPMI-1460 (حتى 20 مل) والطرد المركزي في RT لمدة 5 دقائق عند 1,200 × جم. أعد تعليق خلايا الدم البيضاء في 1 مل من وسط الخلايا التائية. أضف 5 ميكرولتر من معلق الخلية سعة 1 مل إلى وسط خلية T سعة 250 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل واخلطه برفق لأعلى ولأسفل بواسطة الماصة.
6. أضف 25 ميكرولتر من معلق الخلية المخفف إلى 25 ميكرولتر 0.4٪ تريبان بلو. أضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى كل جانب من جوانب مقياس الدم القياسي.
7. ضع مقياس كثافة الدم على مجهر ضوئي منخفض الطاقة. باستخدام هدف 10X ، قم بحساب عدد الخلايا الحية التي استبعدت صبغة Trypan الزرقاء والموجودة في المربع الأوسط لجانبي مقياس الدم.
8. لحساب تركيز الخلية ، اضرب متوسط المربعين في 100 (عامل التخفيف) ثم اضرب في 10⁴ لإعطاء عدد الخلايا / مل.
9. اضبط التركيز النهائي على 0.5 × 10⁶ خلايا / مل في وسط الخلية التائية. أضف تركيزا نهائيا قدره 1 ميكروغرام / مل لكل من المستضدات البكتيرية الفائقة والسموم المعوية بالمكورات العنقودية B (SEB) وسم متلازمة الصدمة السمية 1 (TSST) إلى الخلايا. استزراع لمدة 72 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لتوسيع عدد الخلايا التائية CD4 ⁺.
10. خلايا بيليه التائية (1,200 × جم ، 5 دقائق) وإعادة تعليقها عند 0.5 × 10⁶ خلايا / مل في وسط الخلية التائية مع إضافة IL-15 البشري (20 نانوغرام / مل). نقل الخلايا الليمفاوية إلى قارورة T150. استمر في توسيع / تقسيم الخلايا في وسط كامل - IL-15 كل 24-48 ساعة حسب الحاجة (بناء على لون الوسائط ؛ أي عندما تتحول الوسائط من اللون الوردي إلى الأصفر قليلا) بعد ذلك. الحفاظ على عدد الخلايا الليمفاوية الناتجة لمدة تصل إلى 15 يوما.
    ملاحظه: حسب التصميم ، سيقوم هذا البروتوكول بتنشيط وتوسيع مجموعة فرعية من خلايا CD4 ⁺ T التي تتفاعل مع SEB و TSST ثم يدفعها نحو نمط ظاهري للمستجيب / الذاكرة الشبيه ب Th1. تفشل خلايا الدم البيضاء الأخرى في البقاء على قيد الحياة والنمو في ظل هذه الظروف ، بحيث تكون الخلايا في الخطوة 1.10 على الأقل 95٪ CD4 ⁺ ، CD45RO ⁺ خلايا تائية ، كما يمكن تقييمها بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن تحقيق مزيد من التنقية بسهولة من خلال مجموعات الاختيار الإيجابية أو السلبية القائمة على الأجسام المضادة / الخرزة المغناطيسية المتاحة تجاريا.

< p class = "jove_title" >2. بدء زراعة الخلايا البطانية البشرية الأولية

1. قم بتغطية قارورة T25 بفيبرونيكتين (FN) 20 ميكروغرام / مل في PBS في ظروف معقمة. اتركيه في RT لمدة 30-60 دقيقة. قم بإزالة FN وأضف 5 مل من الوسط الكامل (Endothelial Basal Medium (EBM-2) مع استكمال Endothelial Growth Medium (EGM-2) singlequots). احتضان مسبق في حاضنة زراعة خلايا 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
2. قم بإذابة قارورة من الخلايا البطانية الجلدية للرئة البشرية المجمدة أو الأوعية الدموية الدقيقة (HLMVECs أو HDMVECs) في حمام مائي 37 درجة مئوية مع تحريض لطيف من حين لآخر لمدة ~ 2-3 دقائق. انقل الخلايا على الفور إلى قارورة T25 التي تحتوي على وسائط دافئة مسبقا. قم بتدويره برفق وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
3. قم بتغيير الوسائط بعد ~ 4-6 ساعات. استمر في تغيير الوسائط كل 48 ساعة تقريبا (أو عندما تصبح الوسائط صفراء قليلا) حتى تصل اللوحة إلى ~ 90-95٪ من التقاء.

< p class = "jove_title" >3. الانقسام العام وتوسيع الخلايا البطانية

1. تنمو الخلايا إلى ~ 90-95 التقاء. قد يستغرق هذا 2-5 أيام. للتقسيم ، قم بإزالة الوسائط واشطفها باستخدام PBS. قم بإزالة PBS واستبدلها بحجم أدنى من 1x trypsin الطازج (0.5 مل ل T25 أو 1.5 مل ل T75). قم بتدوين برفق لتغطية جميع الأسطح بالتربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 5 دقائق. راقب انفصال الخلايا عن اللوحة باستخدام مجهر ضوئي منخفض الطاقة.
2. عندما تبدو غالبية الخلايا مستديرة أو منفصلة ، أضف 5 أحجام (أي مقارنة بحجم التربسين المضاف) من وسط EGM-2 الكامل المسخن مسبقا وقم بتسخينه برفق على سطح القارورة لفصل جميع الخلايا.
3. عد الخلايا البطانية باستخدام مقياس كثافة الدم كما هو موضح في 1.6-1.7. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي (5 دقائق ، 1,200 × جم). قم بإزالة المادة الطافية. اضبط التركيز على 0.5 مليون خلية لكل مل عن طريق إضافة وسائط EGM-2 MV كاملة تم تسخينها مسبقا.
4. نقل حصص الخلايا إلى الأطباق أو القوارير المناسبة المطلية بالجبهة الوطنية للصيانة. حركها برفق وضعها في الحاضنة. قم بتغيير الوسائط في غضون 6-12 ساعة من الطلاء. يجب تغيير الوسائط كل 48 ساعة تقريبا بعد ذلك.

4. تعداء الخلايا البطانية

ملاحظة: الخلايا البطانية الأولية مقاومة للتعداء بالطرق الكيميائية والكهربائية الأكثر شيوعا. تسمح الطريقة القائمة على التعداء النووي الموضحة أدناه بكفاءة تعداء عالية نسبيا (~ 50-70٪). وهناك طريقة بديلة فعالة تتمثل في استخدام العدوى بالنواقل الفيروسية المناسبة (انظر التعليقات الواردة في جدول المواد).

1. قم بإعداد قوارير T25 أو T75 (حسب الحاجة) من HLMVECs أو HDMVECs إلى كثافة نهائية تبلغ 90-95٪ من التقاء. قم بتغطيتها بالفبرونيكتين (FN) 20 ميكروغرام / مل في PBS في ظروف معقمة إما ألواح زراعة المجهر مثل ألواح Delta-T (للخطوة 5) أو أغطية زجاجية دائرية مقاس 12 مم موضوعة داخل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا (للخطوة 6) كما هو موضح أعلاه (2.1).
2. أضف 1 مل من وسائط استزراع EGM-2 الكاملة إلى ألواح زراعة المجهر أو 0.5 مل لكل 24 بئر وقم بموازنة الألواح في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. حصاد وعد الخلايا البطانية كما في الخطوات 3.1-3.3. جهاز الطرد المركزي الحجم المطلوب من الخلايا (0.5 مليون خلية لكل عينة) عند 1,200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية في محلول تعداء نووي 100 ميكرولتر RT لكل عينة.
4. امزج 100 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي. نقل تعليق الخلية / الحمض النووي إلى كوفيت معتمد ؛ يجب أن تغطي العينة الجزء السفلي من الكوفيت بدون فقاعات هواء.
   ملاحظة: تم استخدام التركيبات التي تستهدف YFP أو DsRed إلى غشاء الخلية (من خلال 20 من الأحماض الأمينية الطرفية N من neuromodulin التي تحتوي على إشارة للبالميتويلاسیون بعد الترجمة) بمفردها (غشاء YFP وحده أو غشاء DsRed وحده) أو تم نقلها بشكل مشترك مع علامة حجمية سيتوبلازمية (على سبيل المثال ، غشاء YFP و DsRed قابل للذوبان). يمكن استخدام العديد من التباديل لعلامات البروتين الفلوري.
5. أغلق الكوفيت بالغطاء. أدخل الكوفيت مع تعليق الخلية / الحمض النووي في حامل الكوفيت الخاص بالمثقب الكهربائي وقم بتطبيق برنامج التثقيب الكهربائي S-005. أخرج الكوفيت من الحامل بمجرد انتهاء البرنامج.
6. أضف ~ 500 ميكرولتر من وسائط الاستزراع المتوازنة مسبقا إلى الكوفيت وقم بإزالة تعليق الخلية برفق من الكوفيت باستخدام ماصات نقل البلاستيك المتوفرة في مجموعة التعداء النووية.
7. بالنسبة للتجارب التي تستخدم لوحات زراعة المجهر ، تقسم معلق الخلية من تفاعل واحد بالتساوي بين طبقين يحتويان على وسائط دافئة مسبقا (الخطوات 4.2-4.3). بالنسبة للتجارب التي تستخدم 24 بئرا / صفيحة ، قم بتقسيم تفاعل واحد بالتساوي بين 3 آبار.
8. احتضان الخلايا في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ وتغيير الوسائط 4-6 ساعات ، ومرة أخرى بعد 12-16 ساعة بعد التعدين.

< p class = "jove_title" >5. تصوير الخلايا الحية وتحليلها

1. تحضير البطانة
   1. اليوم 0: قم بنقل HLMVECs الأولية مع غشاء YFP و DsRed القابل للذوبان عبر تقنية النواة كما هو موضح في الخطوة 4 ولوحة على لوحات ثقافة تصوير الخلايا الحية.
   2. اليوم 1: استبدل الوسط بوسط جديد يحتوي على IFN-γ (100 نانوغرام / مل) للحث على تعبير معقد التوافق النسيجي النسيجي النسيجي الكبير II. في اليوم 2. تحفيز الخلايا المنقولة عن طريق إضافة 20 نانوغرام / مل من TNF-α إلى الوسائط الموجودة.
   3. في اليوم 3 ، احتضان البطانة ب 1 ميكروغرام / مل لكل من المستضدات الخارقة البكتيرية السموم المعوية بالمكورات العنقودية B (SEB) وسم متلازمة الصدمة السمية 1 (TSST) عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة مباشرة قبل التجارب. احذف هذه الخطوة لظروف التحكم "-Ag".
2. تحضير الخلايا الليمفاوية
   1. بالتوازي مع الخطوة 5.1.3 ، قم بإعداد Buffer A (HBSS الخالي من الفينول الأحمر) مكملا ب 20 ملي مولار HEPES ، ودرجة الحموضة 7.4 ، و 0.5٪ من حجم / حجم ألبومين مصل بشري مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. خذ عينة من الخلايا الليمفاوية المستنبتة وحدد الكثافة عن طريق العد باستخدام مقياس كثافة الدم (الخطوة 1.12-1.17).
   2. جهاز طرد مركزي 2 مليون خلية لكل عينة عند 1,200 × جم لمدة 5 دقائق في RT في أنبوب مخروطي 15 مل. قم بشفط الوسائط وإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق في 2 مل من Buffer A بحيث لا تبقى مجموعات خلايا.
   3. قم بإزالة كمية جديدة من صبغة الكالسيوم Fura-2 وأعد تعليقها في DMSO لعمل تركيز مخزون يبلغ 1 ملليمتر.
   4. أضف 2 ميكرولتر من محلول مخزون Fura-2 إلى تعليق الخلية التائية (التركيز النهائي 2 ميكرومتر) ، وقم بتغطية الأنبوب ، واخلطه على الفور عن طريق قلب الأنبوب لضمان تشتت الصبغة بشكل متساو. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   5. جهاز الطرد المركزي كما في الخطوة 5.2.2. Aspirate Buffer-A وإعادة تعليق الخلايا الليمفاوية برفق ولكن تماما في 20-40 ميكرولتر من Buffer-A الطازج.
3. إعداد التصوير بالخلايا الحية والاستحواذ عليها
   ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الأنظمة للتصوير الفلوري للخلايا الحية على المجاهر الضوئية المستقيمة والمقلوبة. تشمل المتطلبات الأساسية مصدر ضوء مضان ومرشحات ، وكاميرا CCD ، وتبديل المرشح الآلي ، والمصاريع ، ومرحلة ساخنة (أو غرفة تسخين قابلة للتركيب بالمجهر) ، وبرنامج للحصول على الصور الآلي. بالنسبة لهذا البروتوكول ، هناك حاجة إلى فتحة عددية عالية ، وتكبير عالي (أي 40X ، 63X) عدسات غمر بالزيت لتحقيق الدقة المكانية اللازمة. يجب توخي الحذر بشكل خاص في اختيار مصدر التألق المناسب والعدسات لتصوير الكالسيوم المستند إلى Fura-2 حيث لا تتوافق جميعها مع الأطوال الموجية المطلوبة للإثارة 340/380 نانومتر. يمكن استخدام نهج بديل (متوافق مع مجموعات مرشحات التألق الأخضر والأحمر القياسية) مع الأصباغ الحساسة للكالسيوم غير النسبية (على سبيل المثال ، Fluo-4 ، Rhod-3) ، على الرغم من أنها لا يمكنها تحديد تدفق الكالسيوم بدقة وتوفر فقط قراءة نسبية / كمية.
   1. قم بتشغيل نظام المجهر (الكمبيوتر الشخصي للتشغيل ، والمجهر ، وكاميرا CCD ، وعجلة المرشح ، ومصباح الزينون).
   2. افتح البرنامج المخصص.
   3. قم بإعداد المجهر/البرنامج للتصوير التلقائي متعدد القنوات. قم بتضمين الاستحواذ المتسلسل على تباين التداخل التفاضلي (DIC) ، والتألق الأخضر القياسي ، والتألق الأحمر القياسي ، وصور الإثارة القياسية 340 و 380 نانومتر Fura-2. اضبط الفاصل الزمني للاقتناء لمدة 10-30 ثانية ومدة إجمالية ~ 20-60 دقيقة.
      1. اضبط أوقات التعرض لتصوير Fura-2.
         1. أضف زيتا موضوعيا جديدا وقم بتركيب طبق مجهر يحتوي على 0.5 مل فقط من Buffer-A على محول مرحلة التسخين وقم بتشغيله على الفور ليوازن إلى 37 درجة مئوية (سيستغرق ~ 2-3 دقائق).
         2. أضف الخلايا الليمفاوية المحملة ب Fura2 إلى حجرة طبق المجهر المركبة باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر.
         3. قم بتشغيل تصوير المجال الساطع. حدد مسار الضوء إلى العدسات. استخدم مقبض التركيز البؤري الخشن لملامسة الهدف لقاع طبق المجهر. استخدم العدسة ومقبض التركيز الدقيق للتركيز على الخلايا التائية المستقرة في قاع الطبق.
         4. استخدم عناصر تحكم المرحلة xy لتحديد حقل يحتوي على 10 خلايا على الأقل. تجنب الحقول المزدحمة وكتل الخلايا لأنها ستخلق قطع أثرية للتصوير.
         5. قم بالتبديل من مجال ساطع إلى مصدر ضوء الفلورسنت. قم بالتبديل من تصوير العدسات إلى كاميرا CCD. تعيين معلمات الاستحواذ (على سبيل المثال، وقت التعرض وكسب الكاشف وتجميع البيانات). باستخدام البرنامج الحصول على صور Fura2-340 و Fura2-380 (بدءا من وقت التعرض المتطابق لكل منهما ، عادة في حدود ~ 200-1,000 مللي ثانية).
         6. استخدم الطرق الموضحة في الخطوة 5.4.1 لحساب Fura2-340 / Fura2-380 لكل خلية ليمفاوية. قم بإجراء التكرارات المتكررة لضبط أوقات التعرض Fura2-340 و Fura2-380 ، والحصول على الصور ، وحساب النسب حتى يقترب متوسط القيم من 1.
      2. قم بتعيين أوقات التعرض ل mem-YFP و DsRed.
         1. يستعاض عن طبق المجهر المستخدم في الخطوة 1.3.3.5 بطبق مجهر يحتوي على HLMVECs أو HDMVECs المنقولة والمنشطة والمعالجة (أو غير المعالجة ؛ التحكم) من حاضنة زراعة الخلايا (الخطوة 4.5.1). استخدم ماصة نقل يمكن التخلص منها لإزالة الوسائط بسرعة، واشطف مرة واحدة بإضافة ~ 1 مل من Buffer-A الدافئ مسبقا. استنشق ثم أضف 0.5 مل من Buffer-A.
         2. تحديد المجالات التي توجد فيها خلايا بطانة مستقرة موجبة فلورية زاهية وتبدو صحية مع تقاطعات بين الخلايا جيدة التكوين.
         3. اضبط معلمات الاستحواذ (على سبيل المثال ، وقت التعرض ، وكسب الكاشف ، وbinning) ل mem-YFP و DsRed. تأكد من أن متوسط شدة إشارة التألق في كل قناة يتراوح بين 25٪ و 75٪ من النطاق الديناميكي للكاشف.
4. إجراء تجارب تصوير الخلايا الحية.
   1. استخدم برنامجا آليا لبدء الحصول على الصور والتقاط عدة فترات زمنية من الصور لإنشاء خط أساس.
   2. أثناء الاستحواذ ، قم بتطبيق ~ 5 ميكرولتر من الخلايا الليمفاوية المركزة المحملة ب Fura-2 (من الخطوة 5.2) إلى مركز مجال تصوير طبق المجهر عن طريق إدخال طرف ماصة صغيرة الحجم (P-5 أو P-20) في الوسائط القريبة من مركز الهدف وإخراجها ببطء.
   3. عندما تستقر الخلايا الليمفاوية في مجال التصوير ، قم بإجراء تعديلات دقيقة في التركيز لضمان الحفاظ على واجهة الخلية التائية والبطانية (المشابك المناعية) في المستوى البؤري. مع أهداف 40 و 63X ، ~ 10-20 خلية لكل حقل هي الأمثل. إذا لوحظ عدد أقل من الخلايا في حقل التصوير، فكرر الخطوة 5.3.4.2.
   4. بعد اكتمال الفاصل الزمني المطلوب للمراقبة للتجربة ، استمر في التصوير وقم على الفور بماصة الأيونوميسين مباشرة في طبق المجهر (باستخدام التقنية كما في 5.3.4.2) إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكرومتر للحث على أقصى تدفق للكالسيوم / إشارة إشارات Fura-2 (أي وسيلة للمعايرة ، انظر التحليل 5.4.).

المواد