طريقة توطين التألق المناعي في الجسم الحي لدراسة التوزيع الحيوي للأجسام المضادة

الملخص

المصدر: Wischhusen ، J. C. ، et al. In Vivo Immunofluorescence Localization لتقييم التوزيع الحيوي للأجسام المضادة العلاجية والتشخيصية في أبحاث السرطان. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية توطين التألق المناعي في الجسم الحي (IVIL) لدراسة التوزيع الحيوي للأجسام المضادة التي تستهدف الورم في نموذج الفئران لسرطان الثدي. عند الحقن الوريدي لجسم مضاد خاص بالورم في الفأر ، يتم عزل الورم جراحيا ، ويتم تأكيد توطين الجسم المضاد داخل أنسجة الورم عن طريق التلوين المناعي خارج الجسم الحي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. نموذج الفأر المعدل وراثيا لتطور سرطان الثدي

1. راقب الفئران من نموذج السرطان المطلوب لنمو الورم المناسب عن طريق الجس أو قياس الفرجار قبل المتابعة.
   ملاحظه: هنا ، تم استخدام نموذج الفئران المعدلة وراثيا لتطور سرطان الثدي (FVB / N-Tg (MMTV-PyMT) 634Mul / J) (MMTV-PyMT). تصاب هذه تلقائيا بسرطان الثدي الغازي بين 6 و 12 أسبوعا من العمر في كل غدة ثديية. تم استخدام الغدد الثديية الطبيعية كعناصر تحكم من زملائه السلبية للجينات المعدلة ومتطابقة مع العمر.

2. الحقن الوريدي لعوامل الأجسام المضادة المحددة وغير المحددة

1. قم بتنقية الأرانب المضادة للفأر B7-H3 والأجسام المضادة للتحكم في النمط المتساوي للجلوبولين المناعي للأرانب G (IgG) على عمود تحلية المياه (على سبيل المثال ، PD-10) لإزالة المواد الحافظة ومخازن التخزين باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظه: قد تحتاج بعض الأجسام المضادة إلى مزيد من التنقية باستخدام بروتوكول Protein-A القائم على حبيبات الاغاروز.
2. جرعات Aliquot من 33 ميكروغرام من كل مترافق للأجسام المضادة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية.
   ملاحظه: قد تختلف جرعة العامل المعطى اعتمادا على التطبيق وتتطابق مع الجرعات التي يتم فيها استخدام الأجسام المضادة المترافقة بشكل روتيني. مطلوب تركيز محاليل الأجسام المضادة إذا كان الحجم أكثر من 100 ميكرولتر لسلامة.
3. في النقطة الزمنية المطلوبة قبل جمع الأنسجة ، هنا 96 ساعة ، قم بتخدير الحامل للورم بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران المتدفق في الأكسجين عند 2 لتر / دقيقة ، ثم ضعه على مرحلة تسخين 37 درجة مئوية. قم بقرصة إصبع القدم للتأكد من الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير قبل العملية.
4. للتحضير لتلقيح محاليل الأجسام المضادة في وريد الذيل ، قم بتطهير ذيل عن طريق مسحه ثلاث مرات بمنديل كحولي. قم بتوسيع عروق الذيل عن طريق تسخينها باستخدام وسادة حرارية لمدة 30 ثانية تقريبا. تجنب تسخين بأكمله. امسح الذيل مرة أخرى بمنديل كحولي بعد إزالة الوسادة الحرارية.
5. باستخدام قسطرة وريد الذيل 27G ، أدخل إبرة الفراشة في أحد وريد الذيل الجانبي وقم بتثبيت الذيل بعناية بإبرة تم إدخالها على المسرح بقطعة من الشريط الجراحي.
   ملاحظه: يشير التدفق الرجعي للدم إلى القسطرة إلى الموقع الصحيح للإبرة داخل وريد الذيل.
6. اغسل القسطرة ب 25 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم حقن محلول الجسم المضاد في القسطرة باستخدام محاقن الأنسولين. اغسل القسطرة مرة أخرى ب 25 ميكرولتر من PBS المعقم.
7. قم بإزالة الإبرة من الذيل واضغط لوقف أي نزيف.
8. قم بإيقاف تشغيل التخدير ومراقبة حتى يستيقظ تماما بحثا عن أي علامات للضيق.

3. جمع وتحضير أنسجة الورم المستهدفة

1. في المرحلة الزمنية المطلوبة ، قم بالقتل الرحيم للحيوان بشكل إنساني وفقا للإجراء المؤسسي المقبول ، هنا ، عن طريق الاستنشاق التدريجي ل 100٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ من خزان غاز مضغوط بمعدل تدفق إزاحة الغرفة بنسبة 10-30٪ حجم / دقيقة.
   ملاحظه: تتطلب بعض تطبيقات تقنية IVIL القتل الرحيم عن طريق التروية القلبية باستخدام PBS لإزالة الأجسام المضادة المنتشرة بحرية.
2. بعد تأكيد القتل الرحيم الإنساني عن طريق التوقف عن حركة الجهاز التنفسي والقلبي ، وعدم استجابة قرصة إصبع القدم ، وشيب الأغشية المخاطية ، استئصال أنسجة الورم باستخدام المقص الجراحي والملقط على النحو التالي:
   1. ضع الفأر في وضع ضعيف وامسك فقط بالطبقة الخارجية من الجلد بين مجموعة الغدد الثديية الأقرب إلى الذيل (5) بالملقط ، وقم بعمل شق صغير باستخدام مقص جراحي.
   2. أدخل المقص المغلق في الجرح وافتح الطرف ببطء لفصل الجلد بعناية عن غشاء جدار البطن الأساسي مع إبقائه سليما.
   3. قم بعمل شق عمودي في البطن ، مع الاستمرار في فصل الجلد عن الغشاء الداخلي. بين الغدد الثديية 3 و 4 ، قم بعمل قطع أفقي عبر البطن للسماح بتراجع الجلد وتصور الغدد الثديية.
      ملاحظه: تقع أورام الغدد الثديية بشكل سطحي تحت الجلد.
   4. يمسك كل ورم أو غدة طبيعية بالملقط ، وقم بقص الجلد المرفق بعناية باستخدام مقص جراحي.
3. ضع المناديل المستقرة في قوالب قاعدة الأنسجة التي تستخدم لمرة واحدة ، ومسماة مسبقا ومليئة بوسط تضمين درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وقم بتجميد القوالب بسرعة عن طريق وضعها على الثلج الجاف. من أجل دراسة الولادة خارج الهدف ، استئصال الأنسجة أو الأعضاء الأخرى ذات الأهمية (مثل الكبد أو الرئتين).
   ملاحظه: لإيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة ، قم بتخزين كتل المناديل المجمدة عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
4. باستخدام ناظم التبريد ، قم بتقسيم كتل الأنسجة المجمدة بسمك 10 ميكرومتر وضع الأقسام المجاورة على شرائح زجاجية لاصقة مسبقة الوصف.
   ملاحظه: لإيقاف البروتوكول مؤقتا في هذه المرحلة ، قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.

< p class = "jove_title" >4. بروتوكول تلطيخ Ex vivo

ملاحظة: للمقارنة الكمية بين صور الفحص المجهري الفلوري ، يتم تلطيخ جميع الشرائح في نفس الوقت بنفس الحلول المعدة.

1. اشطف شرائح المناديل المجمدة بدرجة حرارة الغرفة PBS لمدة 5 دقائق لإزالة OCT.
حدد
2. أقسام الأنسجة بقلم حاجز مسعور لتقليل حجم المحاليل اللازمة أثناء التلوين.
   ملاحظه: احرص على عدم السماح للقلم بتمرير عينات الأنسجة لأنه قد يزيل الأنسجة من الشريحة أو يمنع تلطيخ الجزء المصاب. لا تسمح لأقسام الأنسجة بالجفاف في أي وقت.
3. ثبت أقسام الأنسجة بمحلول بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 5 دقائق.
4. اشطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
5. تخلل أقسام الأنسجة بنسبة 0.5٪ Triton-X 100 في PBS لمدة 15 دقيقة.
6. اشطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
7. قم بسد الأنسجة باستخدام 3٪ وزن / حجم ألبومين مصل البقر (BSA) و 5٪ v / v مصل الماعز ، كلاهما في PBS (محلول حجب ) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: قم بمطابقة مصل محلول الحجب مع المضيف للجسم المضاد الثانوي.
8. اشطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
9. احتضان الأقسام ذات الأجسام المضادة الأولية التي تحفظ السجلات حسب الرغبة ، وربما تكون نووية شائعة (على سبيل المثال ، DAPI) ، أو الأوعية الدموية (على سبيل المثال ، CD31) ، أو علامة سيتوبلازمية (على سبيل المثال ، الأكتين). هنا ، تم استخدام CD31 المضاد للفأر (علامة الأوعية الدموية) عند تخفيف 1: 100 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في محلول الحظر طوال الليل عند 4 درجات مئوية محمي من الجفاف على صينية منزلقة.
   ملاحظه: لا تضيف أجساما مضادة أولية إضافية أو مترافقة أجسام مضادة. يعمل المترافق الذي تم حقنه والسماح له بالتراكم في الأنسجة في الجسم الحي كجسم مضاد أساسي.
10. اشطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات ، مع تغيير PBS في كل مرة.
11. احتضان الشرائح بالأجسام المضادة الثانوية لتسمية الأجسام المضادة الأولية. بالنسبة لهذا التطبيق ، قم بتصور الجسم المضاد المضاد B7-H3 باستخدام الجسم المضاد للماعز المترافق AlexaFluor-546 (تخفيف 1: 200 ، محسن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) و CD31 مع الجسم المضاد الثانوي للماعز AlexaFluor-488 المضاد للفئران (تخفيف 1: 200 ، محسن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في محلول الحجب ، محمي من الضوء والجفاف على صينية منزلقة ، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظه: الأجسام المضادة الثانوية من نفس المضيف ولكنها تتطابق مع تقارب الأجسام المضادة الثانوية للأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي المعني. الشرائح محمية من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
12. اشطف الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات ، مع تغيير PBS في كل مرة.
13. ضع قطرة واحدة من وسط التثبيت في وسط شريحة الأنسجة وضع غطاء بعناية لتجنب انحباس فقاعات الهواء.
14. أغلق حواف الغطاء بطلاء أظافر شفاف واتركه حتى يجف.
    ملاحظه: لإيقاف البروتوكول مؤقتا لمدة تصل إلى أسبوع في هذه المرحلة ، قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.

< p class = "jove_title" >5. التصوير المجهري متحد البؤر والتحليل الكمي للصور

ملاحظة: يعتمد إعداد المجهر متحد البؤر ومعلمات التصوير على النظام متحد البؤر المستخدم. تم شراء المجهر المستخدم هنا تجاريا (على سبيل المثال ، نظام Zeiss LSM 510 Meta) وتم استخدام برنامج الاستحواذ المرتبط به (على سبيل المثال ، Zen 2009). ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الخطوات ستنطبق على أي مجهر متحد البؤر وتفترض المعرفة الأساسية بالفحص المجهري متحد البؤر.

1. بعد تشغيل النظام وتسخينه ، حدد الهدف المطلوب ؛ هنا تم استخدام هدف 20x (فتحة عددية = 0.8).
2. قم بتحميل شريحة تحكم إيجابية ، مع الغطاء لأسفل ، للسماح بضبط التحسين لأكثر إشارة سطوعا. التصوير في القناة الحمراء ، قم بتركيز النظام على العينة في وضع التصوير المباشر.
3. لكل قناة ليزر مستخدمة ، قم بتحسين شدة الليزر ، والكسب الرئيسي ، وحجم الثقب على النحو التالي:
   1. قم بالتبديل إلى الوضع المستمر للتصوير.
   2. قم بتحسين شدة الليزر (التي تتحكم في طاقة الليزر) والكسب (الرئيسي) (الذي يتحكم في الجهد لأنبوب المضاعف الضوئي) أثناء مراقبة الرسم البياني لجدول البحث (LUT). اضبط هذين الإعدادين حتى يتم ملء النطاق الديناميكي للرسم البياني دون تشبع وحدات البكسل.
      ملاحظه: إذا كانت شدة الليزر عالية جدا ، فسيحدث التبييض الضوئي. إذا كان الكسب (رئيسي) مرتفعا جدا ، فستصبح الصورة صاخبة. من الناحية المثالية ، سيكون الكسب (الرئيسي) في منتصف نطاقه.
   3. اضبط الثقب على وحدة جيدة التهوية (AU) ، مما يعطي أعلى دقة وأنحف شريحة z.
   4. حرك شريط الإزاحة الرقمي لتقليل أرضية الضوضاء على الرسم البياني لجدول البحث للحصول على خلفية سوداء حقيقية.
      ملاحظه: بمجرد تحسين إعدادات الفحص المجهري لكل قناة ليزر وهدف ، حافظ على ثباتها طوال جلسة التصوير وتصوير جميع الشرائح ، للسماح بالمقارنة الكمية بين الشرائح.
4. ضمن علامة التبويب وضع الاكتساب، ضمن المتوسط، حدد الرقم المطلوب وعمق البت. انقر على الزر الأمثل لتعيين حجم البكسل الأمثل.
5. استخدم زر الحصول على Snap لجمع صورة عالية الجودة. هنا ، تم اختيار مجالات رؤية عشوائية من داخل الورم ، ولكن قد تنطبق مجالات الاهتمام الأخرى على تطبيقات مختلفة (الأوعية ، وهوامش الورم ، وعمق الاختراق ، وما إلى ذلك)
6. احفظ ملفات الصور بالتنسيق المستخدم من قبل البرنامج متحد البؤر (هنا ، ".lsm") للمعالجة والقياس الكمي في وضع عدم الاتصال.
   ملاحظه: إذا لم يتم تصوير جميع الشرائح خلال نفس الجلسة ، فاحفظ الإعدادات وأعد تحميلها في الزيارات اللاحقة ، على الرغم من عدم يوصى بإعادة تصوير نفس الشريحة بسبب التبييض الضوئي.
7. إجراء قياسات شدة التألق الكمي. افتح فيجي (فيجي هو مجرد برنامج ImageJ) وقم بتحميل ملف صورة .lsm عن طريق سحبه إلى شريط الحالة.
8. تقسيم بيانات قناة اللون. انتقل إلى Image > Stacks > Split Channels.
9. قم بالمعالجة المسبقة للصور الفلورية حسب الحاجة ، أي طرح إشارة الخلفية (العملية > طرح الخلفية) أو تقليل الضوضاء عبر طريقة التصفية.
10. قم بتقسيم قناة اللون المقابلة للبروتين المرجعي (بقعة وعائية ، نووية ، خلوية) عن طريق تعيين عتبة على شدة الإشارة (الصورة > ضبط عتبة >).
    ملاحظه: يقدم العتبة اليدوية الذاتية في تحليل الصور ، وبالتالي ، فإن استخدام خوارزمية العتبة الآلية أو المخططات البيانية للصور المرجعية يجعل نتائج تحليل الصور أقل تحيزا.
11. استخدم هذا الحد لإنشاء قناع ثنائي (عملية > ثنائي > تحويل إلى قناع).
12. قم بقياس عائد الاستثمار وتسميه داخل القناع (تحليل > تحليل الجسيمات > التحقق من إضافة إلى المدير > موافق).
13. قم بتطبيق عائد الاستثمار على قناة اللون المقابلة للجسم المضاد محل الاهتمام (انقر فوق صورة القناة ، وتحليل أدوات > > مدير > قياس ROI Manager). سيؤدي هذا إلى تطبيق عائد الاستثمار للقناع على صورة الجسم المضاد وتوفير قياسات الصورة لأقسام التسمية في نافذة النتائج. نافذة حفظ النتائج (حفظ > الملف).
14. احسب الإحصائية المطلوبة ذات الأهمية ، مثل متوسط شدة التألق كما هو موضح هنا.
15. قم بتنفيذ جميع خطوات المعالجة بشكل مماثل لكل صورة ضمن مجموعة من الشرائح. قم بإنشاء ماكرو للقيام بذلك تلقائيا لدفعات الصور الكبيرة.
16. لعرض الصورة فقط بعد القياسات الكمية ، قم بتطبيق تعديلات الصورة النوعية لتحسين تصور أنماط التوزيع الحيوي عن طريق ضبط الحد الأدنى والحد الأقصى والسطوع والتباين على نفس المستويات على جميع الشرائح (Image > ضبط > Brightness/Contrast).
17. قم بتحويل نوع الصورة (صورة > النوع > لون RGB) وحفظ الملفات في نوع صورة بدون فقدان مثل .tiff (ملف > حفظ باسم > Tiff ...) لاستخدامها في العروض التقديمية والمنشورات.

المواد