$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. اقتران حبة
- قم بإقران المستضدات بمجموعات الخرز باستخدام التركيزات الموضحة في الجدول 1.
- أضف كل مستضد إلى الخرزات المنشطة وارفع الحجم الإجمالي إلى 500 ميكرولتر في 50 ملي مولار MES ، درجة الحموضة 5.0. امزج المستضدات والخرز عن طريق الدوامة.
- احتضان المستضدات والخرز لمدة ساعتين مع الخلط عن طريق الدوران (~ 15 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بيليه الخرزات المقترنة عن طريق الطرد المركزي الدقيق عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين.
- قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخرزات في 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) - ألبومين مصل الأبقار (BSA) - بولي أوكسي إيثيلين سوربيتان أحادي لورات (Tween-20) - أزيد الصوديوم (PBS-TBN) ، درجة الحموضة 7.4 عن طريق الدوامة والصوتنة. بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي الدقيق عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين وإزالة المادة الطافية
أنذر: أزيد الصوديوم مادة كيميائية شديدة السمية. إنه قاتل إذا ابتلع أو لامس الجلد. لا تتنفس الغبار / الأبخرة / الغاز / الضباب / الأبخرة أو الرذاذ. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل معها والتخلص منها وفقا للقوانين المناسبة.
- أعد تعليق الخرزات في 1 مل من PBS-TBN عن طريق الدوامة والصوتنة لمدة 20 ثانية.
- بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي الدقيق عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين.
- كرر الخطوتين 1.5 و 1.6.
ملاحظه: يوفر هذا ما مجموعه غسلتين باستخدام PBS-TBN.
- أعد تعليق الخرزات المقترنة والمغسولة في 1 مل من PBS ، 1٪ BSA ، 0.05٪ Azide ، درجة الحموضة 7.4. قم بتخزين الخرز المقترن في ثلاجة 2-8 درجة مئوية في الظلام.
< p class = "jove_title" >
2. المقايسة المناعية المتعددة اللعاب
- أخرج اللعاب من الفريزر -80 درجة مئوية واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتعليق مخزون الخرزة المقترنة بالمستضد عن طريق الدوامة والصوتنة لمدة 20 ثانية.
- قم بإعداد خليط حبة العمل عن طريق تخفيف مخزون الخرز المقترن إلى تركيز نهائي يبلغ 100 حبة / ميكرولتر من كل مجموعة حبة فريدة في مخزن BSA PBS-1٪.
- قم بإعداد تخفيف اللعاب بنسبة 1: 4 باستخدام المخزن المؤقت PBS-1٪ BSA في لوح بئر عميق مكون من 96 بئر.
- قم بترطيب لوحة المرشح مسبقا ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل وقم بإزالة المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية.
- أضف 50 ميكرولتر من خليط الخرز العامل وكمية متساوية من اللعاب المخفف إلى 95 بئرا من ألواح الترشيح المكونة من 96 بئرا للتخفيف النهائي بنسبة 1: 8. امزج التفاعلات باستخدام ماصة متعددة القنوات. إلى بئر التحكم الواحد ، أضف 50 ميكرولتر من الخرز المقترن بالمستضد بالإضافة إلى 50 ميكرولتر من PBS-1٪ BSA المؤقت (كبديل للعاب).
- غطيها واتركيها تحتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على شاكر دقيق عند 500 دورة في الدقيقة. قم بإزالة المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية. اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل وقم بإزالة المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية. كرر الغسيل 1x.
- أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولتر من PBS-1٪ BSA باستخدام ماصة متعددة القنوات.
- تمييع الجسم المضاد للكشف الثانوي عن IgG المضاد للإنسان للماعز البيوتينيل إلى 16 ميكروغرام / مل في PBS-1٪ BSA.
- أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر واخلط المحتويات باستخدام ماصة متعددة القنوات.
- قم بتغطية لوحة المرشح واتركها تحتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر اللوحة. قم بإزالة المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية. اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل وقم بإزالة المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية. كرر الغسيل 1x.
- أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولتر من PBS-1٪ BSA باستخدام ماصة متعددة القنوات.
- تمييع مراسل الستربتافيدين-R-phycoerythrin (SAPE) إلى 24 ميكروغرام / مل في PBS-1٪ BSA.
- أضف 50 ميكرولتر من المراسل إلى كل بئر واخلطه باستخدام ماصة متعددة القنوات.
- قم بتغطية لوحة المرشح واتركها تحتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر اللوحة. قم بإزالة المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية. اغسل الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل وقم بإزالة المادة الطافية بالمكنسة الكهربائية. كرر الغسيل 1x.
- أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من PBS-1٪ BSA وحلل 50 ميكرولتر باستخدام المحلل.
ملاحظه: يتم قياس نتائج المقايسة المناعية متعددة الإرسال بوحدات متوسط شدة التألق (MFI). ارجع دائما إلى أحدث إصدار من دليل البرنامج، إذا كان متاحا لتجنب الأخطاء.
< p class = "jove_content" >
الجدول 1: مزيج حبة العمل للمقايسة المناعية متعددة الإرسال.بعد الانتهاء من الاقتران والتأكيد ، تم إعداد مزيج رئيسي يتكون من كل مجموعة حبة كما هو موضح. تم توزيع المزيج الرئيسي على جميع الآبار في اللوحة المكونة من 96 بئرا. تم احتضان جميع الآبار باللعاب باستثناء بئر تحكم في الخلفية يحتوي فقط على حبات و PBS-1٪ BSA عازلة.
مستضد
مجموعة حبة
المخزن المؤقت للاقتران
تركيز Ag (ميكروغرام)
# من الخرز في 1 زاوية
# من الخرز / ميكرولتر
المجلد ل 100 ب / لتر ل 4 مل (ميكرولتر)
جيجوني
8
MES 5.0
50
64
6,400
94
الملوية البوابية
33
MES 5.0
25
71
7,100
85
التهاب الكبد A
42
MES 5.0
100
91
9,100
66
ت. جوندي
30
MES 5.0
25
85
8,500
71
نوروفيروس GII.4
55
MES 5.0
5
72
7,200
83
نوروفيروس GI.1
67
MES 5.0
5
63
6,300
95
غير مقترن
80
MES 5.0
60
6,000
100
إجمالي حجم الخرز (ميكرولتر)
594
إجمالي حجم المخزن المؤقت المطلوب (ميكرولتر)
3,406