قياس التدفق الخلوي الكمي لبلعمة الأبواغ الفطرية بواسطة الخلايا البلعمية البشرية

الملخص

المصدر: Hartung، S.، et al. ، قياس البلعمة في Aspergillus fumigatus Conidia بواسطة الكريات البيض البشرية باستخدام قياس التدفق الخلوي. J. Vis. إكسب. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة لقياس البلعمة للجراثيم الفطرية المسببة للأمراض المسماة ب FITC بواسطة الكريات البيض البشرية. يتم تمييز الجراثيم البلعمة من الجراثيم الملتصقة بالخلايا من خلال التلوين المضاد ، متبوعا بتحليل التدفق الخلوي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. فحص البلعمة

1. احتضان 2 × 10⁶ كريات البيض و 4 × 10⁶ كونيديا تحمل علامة FITC (تعدد العدوى = 2) في 1.5 مل من RPMI + 10٪ FCS في صفيحة زراعة خلية مكونة من 12 بئر. كعناصر تحكم ، قم بتضمين الخلايا فقط (بدون كونيديا) والخلايا + الكونيديا غير المسماة.
2. ضعها في حاضنة CO₂ رطبة عند 37 درجة مئوية واحتضانها للفترة الزمنية المطلوبة (على سبيل المثال ، 0.5 ساعة أو 2 ساعة أو 4 ساعات).
3. بعد الحضانة ، قم بحصاد الخلايا باستخدام مكشطة خلية ووضعها في أنبوب سعة 15 مل.
4. تدور لمدة 5 دقائق عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة.
5. اجمع المادة الطافية لتحليل السيتوكين أو تخلص منها إذا لم تكن مطلوبا. أعد تعليق كل عينة في 100 ميكرولتر من PBS + 2 ملي EDTA.

< p class = "jove_title" >2. تلطيخ الأجسام المضادة

1. لكل عينة ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة ، بما في ذلك الجسم المضاد APC المضاد ل FITC ، وفقا للجدول 1.
2. ضع عينة سعة 100 ميكرولتر في بئر واحد من صفيحة قاع على شكل حرف V سعة 96 بئرا. أضف 150 ميكرولتر من PBS + 2 ملي مولار EDTA للغسيل.
3. لتعويض اللون ، ضع 1 × 10⁶ خلايا لكل لون في آبار أخرى من اللوحة السفلية على شكل حرف V سعة 96 بئرا. قم بتضمين بئر من الخلايا التي تركت دون تلوث. أضف 150 ميكرولتر من PBS + 2 ملي مولار EDTA للغسيل.
4. غطي اللوحة بورق لاصق.
5. تدور لمدة 5 دقائق عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة ورق القصدير.
6. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة بسرعة وبقوة مرة واحدة فقط فوق الحوض أو بمنشفة ورقية يمكن التخلص منها.
   ملاحظة: لا تكرر أو تطرق اللوحة على ورق حتى تجف لأن ذلك سيؤدي إلى فقدان هائل للخلايا من اللوحة.
7. أعد تعليق الخلايا في مزيج الأجسام المضادة سعة 100 ميكرولتر ، واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات.
8. لتعويض اللون ، أعد تعليق الخلايا المعنية في 100 ميكرولتر من PBS + 2 ملي مولار EDTA وأضف جسما مضادا واحدا لكل بئر بنفس الكمية المستخدمة في مزيج الأجسام المضادة.
9. غطيها بورق لاصق وحتضنيها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
10. قم بإزالة ورق القصدير. أضف 150 ميكرولتر من PBS + 2 ملي EDTA إلى كل بئر للغسيل. غطيها بورق لاصق.
11. تدور لمدة 5 دقائق عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة ورق القصدير. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة بسرعة وقوة فوق الحوض أو منشفة ورقية يمكن التخلص منها.
12. أعد تعليق 200 ميكرولتر من PBS + 2 ملي مولار EDTA وانقل الخلايا من كل بئر إلى أنبوب سفلي دائري منفصل. تأكد من عدم وجود مجموعات خلايا في التعليق. قم بإزالة المجموعات بخلاف ذلك.
    ملاحظة: كل مجموعة كبيرة بما يكفي لرؤية العين كبيرة بما يكفي لانسداد مقياس الخلايا.

فئة

3. قياس التدفق الخلوي

1. ابدأ مقياس التدفق الخلوي واتركه يسخن. ابدأ برنامج الاستحواذ.
2. أنشئ تجربة جديدة وقم بإعداد العينات وتسميتها.
3. إعداد المعلمات (FSC 250 ، SSC 250) وأجهزة الكشف عن الفلوروفورات FITC و APC و BUV395 و V500 و PerCP-Cy5.5.
4. إعداد التعويض
   1. افتح إعداد التعويض.
   2. حدد الألوان الفردية.
   3. باستخدام خلايا التحكم التي تركت غير ملوثة أو مع البقع الفردية ، اضبط جهد كاشف PMT ليشمل جميع الأحداث داخل المقياس.
   4. سجل ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عنصر تحكم.
   5. استخدم إعداد التعويض لحساب مدى انتشار الفلوروفورات وتطبيقه على إعدادات مقياس الأخطاء الخلوية للتجربة.
5. تسجيل بيانات العينة
   1. اعرض FSC و SSC في برنامج الاستحواذ وقم بتعيين بوابة حول الكريات البيض.
   2. بناء على بوابة الكريات البيض ، اعرض مخطط النقاط SSC / CD45 وبوابة خلايا CD45 ⁺ للفصل عن الكونيديا.
   3. اعرض خلايا CD45⁺ في مخطط نقطي CD14 / CD66b والخلايا الوحيدة للبوابة (CD14 ⁺) والعدلات (CD66b ⁺) بشكل منفصل.
   4. عرض العدلات في مخطط نقطي مضاد ل FITC / FITC.
   5. باستخدام العينة مع كونيديا غير مسماة ، قم بتعيين أرباع للإشارات المضادة ل FITC و FITC ، مما يسمح بحد أقصى 1٪ من الخلايا في الأرباع المعنية.
   6. كرر الخطوتين 3.5.4 و 3.5.5 لبوابة الخلية الأحادية.
   7. سجل جميع العينات التي تحتوي على 20,000 حدث على الأقل في بوابة الكريات البيض.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: مزيج الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي. يتم إعطاء كميات كل كاشف على شكل ميكرولتر لكل عينة (1 × 10⁶ خلايا) ليتم تحليلها.

الكاشف ميكرولتر لكل عينة CD45 BUV395 1 CD14 V500 0.5 CD66b بيركب-سي5.5 1.5 مكافحة FITC APC 0.5 برنامج تلفزيوني + 2 ملي EDTA 97 مجموع 100

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات رقائق لاصقة وسم 701367 لوحة زراعة الخلية ، 12 بئر غرينر بيو ون 665180 مقياس الخلوي BD Biosciences LSR Fortessa II ، الليزر: 488 نانومتر (أزرق) ، 405 نانومتر (بنفسجي) ، 355 نانومتر (الأشعة فوق البنفسجية) و 640 نانومتر (أحمر) حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سيجما ألدريتش ED3SS-500 جرام 2 ملي مولار في PBS فلورسين إيزوثيوسيانات (FITC) سيجما ألدريتش F3651-100 ملغ 0.1 ملي مولار في محلول Na₂CO₃ / PBS محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثيرموفيشر العلمي 189012-014 بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم RPMI 1640 ثيرموفيشر العلمي 61870010 RPMI 1640 متوسط، مكمل غذائي GlutaMAX برامج للحصول على البيانات وتحليلها BD Biosciences صفيحة قاع على شكل حرف V ، 96 بئر وسم 781601 سطح غير معالج فورمالدهيد كارل روث ص.ب87.3 الهيستوفيكس