مقايسة التألق المناعي لتوصيف وقياس حبيبات الإجهاد في الثدييات

الملخص

المصدر: Aulas، A. et al. ، طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية على أنها حبيبات إجهاد للثدييات.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو فحصا لتوصيف وقياس حبيبات إجهاد الثدييات ، والتي تتكون من mRNAs وبروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs) والعديد من البروتينات الأخرى.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلية

1. أضف أغطية معقمة إلى 12 بئرا من صفيحة 24 بئرا ، كما هو موضح في الشكل 1 أ ؛ يمكن القيام بذلك باستخدام ماصة باستور معقمة متصلة بمكنسة كهربائية لالتقاط كل غطاء. اضغط برفق على الغطاء الموجود على جانب البئر لتحرير الشفط ، مما يسمح للغطاء بالسقوط في البئر.
2. لوحة 1 × 10⁵ U-2 OS (U2OS) خلايا الساركوما العظمية لكل بئر بحجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر من المتوسط. حرك اللوحة من جانب إلى آخر ولأعلى ولأسفل عدة مرات للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي.
3. اضغط برفق على الغطاء لأسفل بطرف P1000 نظيف للتأكد من أن الغطاء في قاع البئر وعدم وجود فقاعات تحت الغطاء.

< p class = "jove_title" >2. إجهاد الخلايا

1. في اليوم التالي ، تحقق بصريا من اللوحة للتأكد من أن الخلايا مشتتة بشكل متساو وتلتقي بالتساوي عبر الغطاء ، حيث قد تؤثر الاختلافات بين العينات سلبا على قابلية تكرار النتائج. استخدم هدف 10X على مجهر زراعة الأنسجة المقلوب.
2. سخن الوسط إلى 37 درجة مئوية. تجنب وضع الوسائط الباردة أو الساخنة على الخلايا ، لأنها تسبب صدمة باردة أو صدمة حرارية ، على التوالي.
3. تمييع الأدوية في وسائط مسخنة مسبقا. لكل تركيز دواء مختلف ، قم بإعداد 2 بئر تحتوي على 500 ميكرولتر من الوسط. قم بإعداد 500 ميكرولتر إضافي للسماح بالفقد أثناء سحب العينات. Aliquot 4 أنابيب ، يحتوي كل منها على 1.5 مل.
   1. بالنسبة لزرنيخيت الصوديوم: إلى كل بئر يحتوي على 500 ميكرولتر ، أضف 1.5 ميكرولتر من 100 ملي مولار من زرنيخيت الصوديوم (التركيز النهائي: 100 ميكرومتر) أو أضف 0.75 ميكرولتر من 100 ملي مولار من زرنيخيت الصوديوم (التركيز النهائي: 50 ميكرومتر).
   2. بالنسبة إلى vinorelbine: إلى كل بئر يحتوي على 500 ميكرولتر ، أضف 22.5 ميكرولتر من 10 ملي مولار فينوريلبين (التركيز النهائي: 150 ميكرومتر) أو أضف 18.75 ميكرولتر من 10 ملي مولار فينوريلبين (التركيز النهائي: 100 ميكرومتر).
      ملاحظه: زرنيخيت الصوديوم هو محفز حبيبات الإجهاد المميز والشائع الاستخدام ، وبالتالي يستخدم بشكل كلاسيكي كعنصر تحكم إيجابي.
4. قم بإزالة الوسائط والتخلص منها من الآبار B1 - 4 و C1 - 4. أضف الوسائط التي تحتوي على المخدرات وانتظر لمدة 60 دقيقة (الشكل 1 أ).
   1. أضف 500 ميكرولتر من الوسط مع 100 ميكرومتر من زرنيخيت الصوديوم إلى الآبار B1 و B2. أضف 500 ميكرولتر من الوسط مع 50 ميكرومتر من زرنيخيت الصوديوم إلى الآبار B3 و B4.
   2. أضف 500 ميكرولتر من الوسط مع 150 ميكرومتر من vinorelbine إلى الآبار C1 و C2. أضف 500 ميكرولتر من الوسط مع 125 ميكرومتر من vinorelbine إلى الآبار C3 و C4.
5. قبل 30 دقيقة من التثبيت ، قم بمعالجة الآبار في العمود 2 ب 5 ميكرولتر من السيكلوهيكسيميد (مخزون 1 مجم / مل) والآبار في العمود 4 ب 2 ميكرولتر من بورومايسين (مخزون 1.25 مجم / مل). قم بهز اللوحة برفق لخلطها قبل وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. تثبيت الخلايا والتألق المناعي

ملاحظة: قبل التجربة ، تأكد من تبريد الميثانول إلى -20 درجة مئوية. قم بعمل مخازن مؤقتة ، بما في ذلك المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، و 5٪ مصل الحصان العادي (NHS) في PBS ، و 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS.

1. تخلص من الوسائط واغسل الآبار التي تحتوي على أغطية باستخدام PBS. اعتمادا على الأدوية المستخدمة ، قد يكون من المهم التخلص من الأدوية المحتوية على الوسائط بشكل صحيح. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تعليمات محددة. للغسيل بكفاءة ، املأ زجاجة ضغط ب PBS ، وقم بقص الطرف للسماح بتدفق لطيف بدلا من تيار ضيق ، واستخدم هذا لإضافة PBS إلى كل بئر بعد شفط PBS الأصلي.
2. قم بإصلاح الخلايا باستخدام ~ 250 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، RT تحت التحريك اللطيف. قم بتغطية الجزء العلوي من الغطاء بالكامل باستخدام PFA ؛ يجب أن يكون 250 ميكرولتر كافيا ، ولكن إذا لم يكن كذلك ، أضف المزيد. تجنب دائما سحب العينات مباشرة على الغطاء، حيث يمكن لبعض الخلايا (أو علاجات الإجهاد للخلايا) أن تغير الارتباط، ويمكن للقوة الناتجة عن سحب العينات أن تزيح الخلايا.
3. قم بإزالة PFA وتخلص منه بشكل صحيح. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تفاصيل حول كيفية التخلص من بارافورمالدهيد بشكل صحيح.
4. أضف ~ 250 ميكرولتر من الميثانول (-20 درجة مئوية) واحتضنه لمدة 5 دقائق في RT تحت هزاز لطيف ؛ وهذا يتخلل الخلايا ويسطحها.
5. قم بإزالة الميثانول والتخلص منه وحظر الخلايا عن طريق تطبيق ~ 250 ميكرولتر من 5٪ NHS لمدة ساعة واحدة في RT بين عشية وضحاها ، O / N ، عند 4 درجات مئوية. اتصل بمكتب السلامة البيئية المحلي للحصول على تفاصيل حول كيفية التخلص من الميثانول بشكل صحيح.
6. بالنسبة للأجسام المضادة الأولية ، قم بتخفيف الأجسام المضادة في 5٪ NHS.
   ملاحظه: يعد استخدام علامات SG متعددة أمرا أساسيا لتأكيد ما إذا كانت الحبيبات المرصودة هي SGs حسنة النية. يعتمد عدد علامات SG التي يمكن استخدامها على المرشحات المتوفرة في المجهر. إذا توفرت مجموعات مرشحات قياسية باللون الأخضر والأحمر والأحمر البعيد، فاستخدم G3BP1 وeIF4G وeIF3b عند تخفيف 1/250.
   1. لهذه التجربة (12 غطاء عند 250 ميكرولتر لكل منهما - الإجمالي: 3 مل من 5٪ NHS) ، أضف 12 ميكرولتر من كل مما يلي: anti-G3BP1 ، وanti-eIF3b ، ومضاد ل eIF4G. احتضان الأجسام المضادة الأولية باستخدام التحريك اللطيف لمدة ساعة واحدة على الأقل عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
7. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام PBS ، واحتضن كل غسلة لمدة 5 دقائق.
8. بالنسبة للأجسام المضادة الثانوية ، قم بتخفيف جميع الأجسام المضادة الثانوية (1/250 تخفيف) وصبغة Hoechst (1 / 1,000 تخفيف) في 5٪ NHS.
   1. لهذه التجربة (12 غطاء عند 250 ميكرولتر لكل منهما - الإجمالي: 3 مل من 5٪ NHS) ، أضف 12 ميكرولتر من كل مما يلي: Cy2-Mouse و Cy3-Rabbit و Cy5-Goat (تخفيف 1/250 لكل منهما) وأضف 3 ميكرولتر من صبغة Hoechst.
   2. احتضان الغطاء مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT. خلال هذه الخطوة والخطوات التالية ، قم بحماية العينات من الضوء عن طريق تغطية اللوحة بصندوق أو عن طريق وضع رقائق معدنية فوق الجزء العلوي من طبق زراعة الأنسجة.
9. اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
10. قم بتركيب الغطاء على شرائح زجاجية ملصقة باستخدام وسيط تثبيت. قم بتسخين وسط التركيب في كتلة حرارية 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ هذا يقلل من اللزوجة ويسهل الماصة. مع طرف P200 مقطوع ، ماصة 25 ميكرولتر من وسط التركيب لكل غطاء على شريحة زجاجية ؛ يمكن أن تتناسب 4-8 أغطية مع شريحة زجاجية واحدة ، على افتراض أن مرحلة المجهر تسمح بذلك. باستخدام ملقط دقيق ، انقل الغطاء من البئر إلى الشريحة ، مع التأكد من وضع جانب الخلية لأسفل على وسط التثبيت. باستخدام طرف P200 نظيف ، اضغط على الغطاء لأسفل.
11. بمجرد تركيب جميع أغطية الغطاء ، استخدم مناديل المختبر المطوية لتنظيف وسط التثبيت الزائد عن طريق الضغط على أنسجة المختبر بقوة شديدة على الشريحة. استخدم زجاجة ضغط تحتوي على H₂O لطرد وسط التثبيت الزائد ثم كرر النشاف بأنسجة المختبر المطوية لإزالة الماء.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: المخططات التجريبية. (أ) خلايا البذور على أغطية موضوعة مسبقا في صفيحة من 24 بئرا ، كما هو موضح. عالج الصفين A و B لمدة 60 دقيقة باستخدام SA أو VRB باستخدام التركيز بالميكرومتر كما هو موضح. بعد 60 دقيقة ، أضف CHX (التركيز النهائي: 20 ميكروغرام / مل للعمود 2) أو بورو (20 ميكروغرام / مل بورومايسين للعمود 4) إلى الوسط المحتوي على الدواء. استمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نظام التشغيل U-2 ATCC ATCC®HTB-96™ - مكتوبة بشكل شائع باسم "U2OS"
- الاستزراع عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 10٪ FBS / DMEM تعديل Dulbecco لوسط النسر كورنينج 10-013-السيرة الذاتية - اختصار DMEM
- يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز والبيروفات والفينول الأحمر
- مكمل بنسبة 10٪ FBS و 10 ملي مولار HEPES و البنسلين / ستيبتومايسين
- التخفيف قبل التدفئة السابقة للأدوية
- التخفيف المسبق للأدوية (الأدوية) مصل الأبقار الجنينية سيغما F2442-500 مل - اختصار FBS
- تستخدم لتكملة الوسائط هيبس (1 م) ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 15630-080 - تستخدم لتكملة الوسائط البنسيلين ستربتومايسين سيغما P0781-100 مل - تستخدم لتكملة الوسائط 24 طبق بئر كوستار 3524 أنسجة المختبر كيم تيك ساينس 34120 - يطلق عليه عادة "kimwipes" غطاء زجاجي لنظارات غطاء النمو فيشر ساينتيك 12-545-82 - تعقيم قبل الاستخدام
- حافظ على معقمه في غطاء مزرعة الأنسجة الصوديوم (ميتا) الزرنيخ ≥90٪ سيغما S7400-100G - يطلق عليه عادة زرنيخيت الصوديوم والاختصار SA
- الذوبان في الماء بتركيز 1 متر ، ثم تخفيفه إلى 100 ميكرومتر كمخزون عامل فينورلبين TSZ كيم RS055 - اختصار VRB
- تذوب في الماء حتى 10 ملي مولار بوروميسين سيغما ص 9620 - تستخدم لتقييم مستوى الترجمة (الريبوبوروميسيلation) < BR / > - تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- يخفف في الماء إلى 10 مجم / مل هيدرات ثنائي هيدروكلوريد إيميتين سيغما E2375 - تستخدم بالاشتراك مع PURO لتقييم مستوى الترجمة العام
- تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- يخفف في الماء إلى 10 مجم / مل سيكلوهيكسيميد سيغما سي 4859 - اختصار CHX
- تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- يخفف في الماء إلى 10 مجم / مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات لونزا / VWR 95042-486 - اختصار PBS
- عازلة الغسيل للتألق المناعي درجة كاشف بارافورمالدهايد ، بلورية سيغما P6148-500G - اصنع محلول 4٪ في PBS الساخن في غطاء الدخان ، وحركه حتى يذوب
- يمكن تخزين الحصص عند - 20 درجة مئوية لعدة أشهر
- خطير ، استخدم التهوية
- تخلص من النفايات الخاصة الميثانول ، ACS BDH / VWR BDH1135-4 ليرة لبنانية - مبردة مسبقا إلى -20 درجة مئوية قبل الاستخدام
- تخلص من النفايات الخاصة مصل الحصان العادي ثيرمو فيشر العلمي 31874 - اختصار NHS
- خفف إلى 5٪ في PBS
- أضف أزيد الصوديوم للتخزين عند 4 درجات مئوية < برميل / > - محلول مانع للتألق المناعي الإيثانول ، نقي ، 200 دليل (100٪) ، USP ، KOPTEC مختبرات ديكون / VWR 89125-188 - خفف إلى 70٪ بالماء شرائح مجهر Fisherbrand Superfrost Plus فيشربراند 12-550-15 الجسم المضاد للفأر المضاد G3BP1 (TT-Y) سانتا كروز SC-81940 - يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية
- استخدم عند تخفيف 1/100 الأرانب المضادة للجسم المضاد eIF4G (H-300) سانتا كروز SC-11373 - يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية
- 1/250 تخفيف الماعز المضاد للجسم المضاد eIF3η (N-20) سانتا كروز SC-16377 - يعرف eIF3η أيضا باسم eIF3b
- يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/250 تخفيف Cy2 AffiniPure الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 715-225-150 - أعد تكوينه في الماء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/250 تخفيف Cy3 AffiniPure الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 711-165-152 - أعد تكوينه في الماء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/2500 تخفيف Cy5 AffiniPure الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 705-175-147 - أعد تكوينه في الماء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/250 تخفيف حل Hoechst 33258 سيغما 94403-1 مل - احتضان بمحلول مخزون الأجسام المضادة الثانوية 0.5 مجم / مل في dH20 ، يحميه من الضوء - يحفظ في 4 درجات مئوية 20 × مخزن مؤقت SSC ثيرمو فيشر أمبيون AM9763 - يخفف إلى 2X SSC باستخدام الماء الخالي من RNase (معالج ب DEPC) - يخزن في درجة حرارة الغرفة - مخزن مؤقت للغسيل للأسماك وسائط تركيب الشرائح صنع منزلي / - امزج 5 جم من بولي "القابل للذوبان على البارد" (كحول الفينيل) في 20 مل من PBS - تخلط عن طريق الصوتنة ، متبوعا بالتقليب طوال الليل في RT- أضف 5 مل من الجلسرين و 0.2 مل من أزيد الصوديوم بنسبة 20٪ ، ويقلب لمدة 16 ساعة في RT- الطرد المركزي عند 20،000 جم لمدة 20 دقيقة ، وتخلص من حبيبات كبيرة - سائل لزج ، تخزين طويل الأجل عند -20 درجة مئوية ، أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية بارافيلم "M" سيغما P7793-1EA - يشار إليها عادة باسم "بارافيلم" بولي (كحول فينيل) سيغما ف - 8136-250 جرام - كاشف لصنع الفينول الجلسرين سيغما G5516-100ML - كاشف لصنع الفينول أزيد الصوديوم فيشر ساينتيك S2002-5G - عامل حافظة لحجب المحلول و vinol
- قم بتخفيف 20٪ في الماء