مقايسة التألق المناعي لتوصيف وقياس حبيبات الإجهاد في الثدييات

الملخص

المصدر: Aulas، A. et al. ، طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية على أنها حبيبات إجهاد للثدييات.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو فحصا لتوصيف وقياس حبيبات إجهاد الثدييات ، والتي تتكون من mRNAs وبروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs) والعديد من البروتينات الأخرى.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلية

1. أضف أغطية معقمة إلى 12 بئرا من صفيحة 24 بئرا ، كما هو موضح في الشكل 1 أ ؛ يمكن القيام بذلك باستخدام ماصة باستور معقمة متصلة بمكنسة كهربائية لالتقاط كل غطاء. اضغط برفق على الغطاء الموجود على جانب البئر لتحرير الشفط ، مما يسمح للغطاء بالسقوط في البئر.
2. لوحة 1 × 10⁵ U-2 OS (U2OS) خلايا الساركوما العظمية لكل بئر بحجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر من المتوسط. حرك اللوحة من جانب إلى آخر ولأعلى ولأسفل عدة مرات للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي.
3. اضغط برفق على الغطاء لأسفل بطرف P1000 نظيف للتأكد من أن الغطاء في قاع البئر وعدم وجود فقاعات تحت الغطاء.

< p class = "jove_title" >

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: المخططات التجريبية. (أ) خلايا البذور على أغطية موضوعة مسبقا في صفيحة من 24 بئرا ، كما هو موضح. عالج الصفين A و B لمدة 60 دقيقة باستخدام SA أو VRB باستخدام التركيز بالميكرومتر كما هو موضح. بعد 60 دقيقة ، أضف CHX (التركيز النهائي: 20 ميكروغرام / مل للعمود 2) أو بورو (20 ميكروغرام / مل بورومايسين للعمود 4) إلى الوسط المحتوي على الدواء. استمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نظام التشغيل U-2 ATCC ATCC®HTB-96™ - مكتوبة بشكل شائع باسم "U2OS"
- الاستزراع عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 10٪ FBS / DMEM تعديل Dulbecco لوسط النسر كورنينج 10-013-السيرة الذاتية - اختصار DMEM
- يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز والبيروفات والفينول الأحمر
- مكمل بنسبة 10٪ FBS و 10 ملي مولار HEPES و البنسلين / ستيبتومايسين
- التخفيف قبل التدفئة السابقة للأدوية
- التخفيف المسبق للأدوية (الأدوية) مصل الأبقار الجنينية سيغما F2442-500 مل - اختصار FBS
- تستخدم لتكملة الوسائط هيبس (1 م) ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 15630-080 - تستخدم لتكملة الوسائط البنسيلين ستربتومايسين سيغما P0781-100 مل - تستخدم لتكملة الوسائط 24 طبق بئر كوستار 3524 أنسجة المختبر كيم تيك ساينس 34120 - يطلق عليه عادة "kimwipes" غطاء زجاجي لنظارات غطاء النمو فيشر ساينتيك 12-545-82 - تعقيم قبل الاستخدام
- حافظ على معقمه في غطاء مزرعة الأنسجة الصوديوم (ميتا) الزرنيخ ≥90٪ سيغما S7400-100G - يطلق عليه عادة زرنيخيت الصوديوم والاختصار SA
- الذوبان في الماء بتركيز 1 متر ، ثم تخفيفه إلى 100 ميكرومتر كمخزون عامل فينورلبين TSZ كيم RS055 - اختصار VRB
- تذوب في الماء حتى 10 ملي مولار بوروميسين سيغما ص 9620 - تستخدم لتقييم مستوى الترجمة (الريبوبوروميسيلation) < BR / > - تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- يخفف في الماء إلى 10 مجم / مل هيدرات ثنائي هيدروكلوريد إيميتين سيغما E2375 - تستخدم بالاشتراك مع PURO لتقييم مستوى الترجمة العام
- تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- يخفف في الماء إلى 10 مجم / مل سيكلوهيكسيميد سيغما سي 4859 - اختصار CHX
- تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- يخفف في الماء إلى 10 مجم / مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات لونزا / VWR 95042-486 - اختصار PBS
- عازلة الغسيل للتألق المناعي درجة كاشف بارافورمالدهايد ، بلورية سيغما P6148-500G - اصنع محلول 4٪ في PBS الساخن في غطاء الدخان ، وحركه حتى يذوب
- يمكن تخزين الحصص عند - 20 درجة مئوية لعدة أشهر
- خطير ، استخدم التهوية
- تخلص من النفايات الخاصة الميثانول ، ACS BDH / VWR BDH1135-4 ليرة لبنانية - مبردة مسبقا إلى -20 درجة مئوية قبل الاستخدام
- تخلص من النفايات الخاصة مصل الحصان العادي ثيرمو فيشر العلمي 31874 - اختصار NHS
- خفف إلى 5٪ في PBS
- أضف أزيد الصوديوم للتخزين عند 4 درجات مئوية < برميل / > - محلول مانع للتألق المناعي الإيثانول ، نقي ، 200 دليل (100٪) ، USP ، KOPTEC مختبرات ديكون / VWR 89125-188 - خفف إلى 70٪ بالماء شرائح مجهر Fisherbrand Superfrost Plus فيشربراند 12-550-15 الجسم المضاد للفأر المضاد G3BP1 (TT-Y) سانتا كروز SC-81940 - يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية
- استخدم عند تخفيف 1/100 الأرانب المضادة للجسم المضاد eIF4G (H-300) سانتا كروز SC-11373 - يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية
- 1/250 تخفيف الماعز المضاد للجسم المضاد eIF3η (N-20) سانتا كروز SC-16377 - يعرف eIF3η أيضا باسم eIF3b
- يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/250 تخفيف Cy2 AffiniPure الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 715-225-150 - أعد تكوينه في الماء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/250 تخفيف Cy3 AffiniPure الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 711-165-152 - أعد تكوينه في الماء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/2500 تخفيف Cy5 AffiniPure الحمار المضاد للماعز IgG (H + L) جاكسون للأبحاث المناعية 705-175-147 - أعد تكوينه في الماء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ثم قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية < برميل / > - 1/250 تخفيف حل Hoechst 33258 سيغما 94403-1 مل - احتضان بمحلول مخزون الأجسام المضادة الثانوية 0.5 مجم / مل في dH20 ، يحميه من الضوء - يحفظ في 4 درجات مئوية 20 × مخزن مؤقت SSC ثيرمو فيشر أمبيون AM9763 - يخفف إلى 2X SSC باستخدام الماء الخالي من RNase (معالج ب DEPC) - يخزن في درجة حرارة الغرفة - مخزن مؤقت للغسيل للأسماك وسائط تركيب الشرائح صنع منزلي / - امزج 5 جم من بولي "القابل للذوبان على البارد" (كحول الفينيل) في 20 مل من PBS - تخلط عن طريق الصوتنة ، متبوعا بالتقليب طوال الليل في RT- أضف 5 مل من الجلسرين و 0.2 مل من أزيد الصوديوم بنسبة 20٪ ، ويقلب لمدة 16 ساعة في RT- الطرد المركزي عند 20،000 جم لمدة 20 دقيقة ، وتخلص من حبيبات كبيرة - سائل لزج ، تخزين طويل الأجل عند -20 درجة مئوية ، أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية بارافيلم "M" سيغما P7793-1EA - يشار إليها عادة باسم "بارافيلم" بولي (كحول فينيل) سيغما ف - 8136-250 جرام - كاشف لصنع الفينول الجلسرين سيغما G5516-100ML - كاشف لصنع الفينول أزيد الصوديوم فيشر ساينتيك S2002-5G - عامل حافظة لحجب المحلول و vinol
- قم بتخفيف 20٪ في الماء