اختبار لتقييم البلعمة ونشاط الانفجار التأكسدي في الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة

الملخص

المصدر: Meaney، M. P. et al. ، قياس الخلايا الحبيبية والبلعمة وحيدة الخلية ونشاط الانفجار التأكسدي في دم الإنسان. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو الاختبار لتأكيد نشاط البلعمة بواسطة الخلايا في دم الإنسان عن طريق قياس التدفق الخلوي. تؤكد الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة نشاطها البلعمي من خلال إظهار التألق الأخضر والأحمر الذي يؤكد وجود البكتيريا المبتلعة ونشاط الانفجار التأكسدي على التوالي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

1. إعداد الفحص

1. جمع المواد المحددة للإجراء وإعدادها وتنظيمها (يرجى الرجوع إلى جدول المواد / المعدات المحددة).
   1. تسمية أنابيب 12 × 75 مم.
      1. قم بتسمية أنبوبين لكل مشارك: أنبوب واحد لمقايسة البلعمة (قم بتسمية هذا الأنبوب بالحبر الأسود و "F" لإيزوثيوسيانات الفلورسين [FITC]) وأنبوب واحد لمقايسة نشاط الانفجار التأكسدي (OB) (قم بتسمية هذا الأنبوب بالحبر الأحمر و "H" لثنائي هيدروإيثيديوم [HE]).
         ملاحظه: يوصى باستخدام أنابيب معقمة مقاس 12 × 75 مم لتقليل التنشيط الخلوي غير المقصود والزيادة المرتبطة به في ضوضاء الخلفية.
      2. قم بتسمية ثلاثة أنابيب لعناصر التحكم في الفحص: أنبوب واحد لمقايسة البلعمة (تحكم FITC: قم بتسمية هذا الأنبوب بالحبر الأسود و "F") ، وأنبوب واحد لمقايسة نشاط OB (تحكم HE: قم بتسمية هذا الأنبوب بالحبر الأحمر و "H") ، وأنبوب واحد للتحكم السلبي (الدم فقط: قم بتسمية هذا الأنبوب بالحبر الأخضر و "الدم فقط").
   2. قم بإعداد محاليل المخزون قبل يوم واحد على الأقل من يوم الفحص.
      1. تحضير المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (PBS). خفف 100 مل من 10x PBS مع 900 مل من 18.2 MΩ H₂O. تعقيم المرشح بفلتر 0.2 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      2. تحضير الجلوكوز المعقم PBS. قم بإذابة 1.0 غرام من الجلوكوز في 100 مل من PBS. تعقيم الفلتر بفلتر 0.2 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      3. تحضير عازلة سترات معقمة 0.1 متر. قم بإذابة 1.2 جم من حامض الستريك و 1.1 جم من سترات الصوديوم في 100 مل من 18.2 MΩ H₂O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.0. تعقيم الفلتر بفلتر 0.2 ميكرومتر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      4. قم بإعداد محلول مخزون HE. أعد تعليق 1.0 مجم من HE في 1.0 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تخلط برفق ، وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      5. تحضير محلول مخزون المكورات العنقودية الذهبية (المكورات العنقودية الذهبية) المسمى بتقنية FITC (2 × 10⁹ جزيئات / مل). يجب إعادة تعليق 10 ملغ من المكورات العنقودية الذهبية المسمى بتقنية FITC في 1.5 مل (أو كمية مناسبة) من PBS. قسم إلى ثلاثة 500 ميكرولتر من الحصص والصوتنة وفقا لتوصية الشركة المصنعة. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      6. تحضير محلول مخزون المكورات العنقودية الذهبية غير المسمى (2 × 10⁹ جزيئات / مل). أعد تعليق 100 مجم من المكورات العنقودية الذهبية غير المسمى في 15 مل (أو كمية مناسبة) من PBS. قسم إلى ثلاثين 500 ميكرولتر من الأصوات والصوتنة وفقا لتوصية الشركة المصنعة. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   3. قم بإعداد حلول عمل جديدة في يوم الفحص.
      1. قم بإعداد حل عمل HE. نقل 10 ميكرولتر من محلول مخزون HE المذاب إلى 990 ميكرولتر من PBS-glucose. يحفظ من الضوء ويحفظ على الثلج حتى الاستخدام.
      2. تحضير حل عمل المكورات العنقودية الذهبية المسمى بتقنية FITC (133,333 جسيما/ميكرولتر). انقل 70 ميكرولتر من محلول مخزون S. aureus المذاب المسمى بتقنية FITC إلى 980 ميكرولتر من PBS. يحفظ من الضوء ويحفظ على الثلج حتى الاستخدام.
      3. تحضير محلول عمل المكورات العنقودية الذهبية غير المسمى (133،333 جسيم / ميكرولتر). انقل 70 ميكرولتر من محلول مخزون المكورات العنقودية الذهبية المذاب غير المسمى إلى 980 ميكرولتر من PBS. يحفظ من الضوء ويحفظ على الثلج حتى الاستخدام.
      4. تحضير محلول الإخماد. أضف 750 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق 0.4٪ إلى 11.25 مل من محلول سترات معقم 0.1 M. يحفظ في حمام ماء مثلج حتى الاستخدام.
   4. اطلب من أخصائي الفصد المعتمد سحب الدم وفقا لإرشادات منظمة الصحة العالمية لسحب الدم.
      1. اسحب الدم إلى أنبوب جمع دم واحد سعة 4 مل يحتوي على حمض ثنائي البوتاسيوم إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (K₂EDTA). اقلب أنبوب جمع الدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتفظ بأنبوب جمع الدم في درجة حرارة الغرفة على هزاز أعلى الطاولة حتى الاستخدام. استخدم هذا الدم لتعداد الدم الكامل (CBC) مع التحليل التفاضلي لخلايا الدم البيضاء (WBC) الموصوف في الخطوة 1.2.1.
      2. اسحب الدم إلى أنبوب جمع دم واحد سعة 4 مل يحتوي على هيبارين الليثيوم. اقلب أنبوب جمع الدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتفظ بأنبوب جمع الدم في درجة حرارة الغرفة (RT) على كرسي هزاز أعلى الطاولة حتى الاستخدام. استخدم هذا الدم لبلعمة الخلايا الوحيدة والخلايا الحبيبية ومقايسة نشاط OB الموصوفة في الخطوة 2.
2. حدد كمية البكتيريا (أي المكورات العنقودية الذهبية) التي ستكون مطلوبة لإكمال الفحص لكل عينة.
   1. استخدم محلل أمراض الدم لإجراء CBC مع تحليل تفاضلي WBC على الدم كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. قم بتدوين عدد كرات الدم البيضاء (في الخلايا / مل) ، ٪ العدلات ، و ٪ أحادية النواة.
   2. استخدم المعادلات أدناه لتحديد عدد العدلات والخلايا الوحيدة لكل عينة. < / > عدد العدلات (في الخلايا / مل) = ٪ عدلات × كرات الدم البيضاء (في الخلايا / مل)
      عدد الخلايا الوحيدة (في الخلايا / مل) = ٪ أحادية الخلية × كرات الدم البيضاء (في الخلايا / مل)
   3. استخدم المعادلات أدناه لتحديد عدد الخلايا البلعمية لكل عينة وعدد الخلايا البلعمية الموجودة في 100 ميكرولتر من العينة.
      عدد الخلايا البلعمية (في الخلايا / مل) = عدد العدلات (في الخلايا / مل) + عدد الخلايا الوحيدة (في الخلايا / مل)
      عدد الخلايا البلعمية في 100 ميكرولتر = (عدد الخلايا البلعمية (في الخلايا / مل)) / 10
   4. استخدم المعادلة أدناه لتحديد عدد البكتيريا (أي المكورات العنقودية الذهبية) اللازمة لكل عينة وكمية المكورات العنقودية الذهبية المسمى بتقنية FITC أو محلول عمل المكورات العنقودية الذهبية غير المسمى (133،333 جسيما / مل) التي يجب إضافتها إلى كل أنبوب.
      ملاحظه: البكتيريا المستهدفة: نسبة البلعمة هي 8: 1.
      عدد البكتيريا المطلوبة = عدد الخلايا البلعمية في 100 ميكرولتر × 8
      حجم FITC أو محلول العمل غير المسمى المطلوب (بالميكرولتر) = (عدد البكتيريا المطلوبة) / (133،333 جسيما / ميكرولتر)

2. إجراء الفحص

1. تحضير الدم الكامل للمقايسة.
   1. لكل مشارك وأنبوب تحكم، استخدم طرف ماصة ممتد الطول لنقل 100 ميكرولتر من الدم الكامل من أنبوب جمع الدم بالهيبارين بالليثيوم إلى قاع أنبوب 12 × 75 مم المسمى بشكل مناسب. استبدل caps.
      ملاحظه: احرص على تجنب دخول الدم إلى جوانب الأنابيب مقاس 12 × 75 مم.
   2. استخدم ماصة دقيقة لإضافة 10 ميكرولتر من محلول عمل HE إلى الأنابيب المصنفة بالحبر الأحمر والحرف "H"، بما في ذلك أنبوب التحكم في HE. استبدل الأغطية والدوامة لفترة وجيزة.
   3. احتضان جميع الأنابيب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، انقل جميع الأنابيب على الفور إلى حمام ماء مثلج لمدة 12 ><دقيقة. ملاحظه: استخدم رفا معدنيا مفتوحا وقم بهز الرف برفق كل 5 دقائق للتأكد من تسخين الأنابيب أو تبريدها بسرعة وبشكل كاف.
2. أضف البكتيريا (أي المكورات العنقودية الذهبية) إلى العينة وأنابيب التحكم.
   1. استخدم ماصة دقيقة لإضافة الكمية المناسبة (المحسوبة في الخطوة 1.2.4) من محلول عمل المكورات العنقودية الذهبية غير المسمى إلى الأنابيب المصنفة بالحبر الأحمر والحرف "H"، بما في ذلك أنبوب التحكم في HE. استبدل الأغطية والدوامة لفترة وجيزة.
   2. استخدم ماصة دقيقة لإضافة الكمية المناسبة (المحسوبة في الخطوة 1.2.4) من محلول عمل المكورات العصفوية الذهبية المسمى بتقنية FITC إلى الأنابيب المصنفة بالحبر الأسود والحرف "F"، بما في ذلك أنبوب التحكم FITC. استبدل الأغطية والدوامة لفترة وجيزة.
   3. دوامة أنبوب التحكم "الدم فقط" ، لكن لا تضيف أيا من البكتيريا (أي المكورات العنقودية الذهبية) إليه.
   4. احتضن جميع الأنابيب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم رفا معدنيا مفتوحا وقم بهز الرف برفق كل 5 دقائق لضمان تسخين الأنابيب بسرعة وبشكل كاف. بعد فترة الحضانة ، انقل جميع الأنابيب على الفور إلى حمام ماء مثلج لمدة 1 دقيقة.
3. اغسل الخلايا.
   1. استخدم ماصة مكرر لإضافة 100 ميكرولتر من محلول التبريد المثلج إلى جميع الأنابيب. استبدل الأغطية ، الدوامة لفترة وجيزة ، ثم احتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 1 دقيقة.
   2. استخدم ماصة مكرر لإضافة 1 مل من PBS المثلج إلى جميع الأنابيب. دوامة لفترة وجيزة ، ثم أضف 2 مل إضافية من PBS المثلج إلى جميع الأنابيب واستبدل الأغطية. جهاز الطرد المركزي جميع الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية و 270 × جم ، ثم استنشق المادة الطافية.
   3. كرر الخطوة 2.3.2 مرة واحدة (إجمالي غسلتين).
4. تحضير عينات لقياس التدفق الخلوي.
   1. استخدم ماصة مكررة لإضافة 50 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية المثلج إلى جميع الأنابيب. باختصار دوامة جميع الأنابيب.
   2. انقل جميع الأنابيب إلى دائري مناسب واستخدم محطة عمل آلية لتحضير ليز الخلية مع تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) وكواشف تثبيت كرات الدم البيضاء لتحلل كرات الدم الحمراء وإصلاح كرات الدم البيضاء كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنابيب 12 × 75 مم ، مع غطاء VWR 20170-579 ستحتاج إلى أنبوبين لكل عينة ("H" و "F") بالإضافة إلى 3 أنابيب لكل دفعة (لعناصر التحكم في الفحص ؛ "F" و "H" و "Blood فقط"). PBS (10X) ، الرقم الهيدروجيني 7.4 تقنيات الحياة 70011-044 أعلى الزجاجة 0.2 ميكرومتر فلتر أسيتات السليلوز (سعة 500 مل) فيشر ساينتيك 09-741-07 الجلوكوز والمسحوق تقنيات الحياة 15023-021 حامض الستريك (اللامائي ، تم اختبار زراعة الخلايا ، اختبار زراعة الخلايا النباتية) سيجما ألدريتش سي 2404-100 جرام سترات الصوديوم ثلاثي القاعدة ثنائي الهيدرات سيجما ألدريتش S4641-25G ثنائي هيدرو إيثيديوم (هيدروإيثيدين) (HE) تقنيات الحياة د11347 ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) اللامائي تقنيات الحياة د12345 المكورات العنقودية الذهبية (سلالة الخشب بدون بروتين أ) الجسيمات الحيوية ، مترافنة الفلورسين (FITC) تقنيات الحياة S2851 المكورات العنقودية الذهبية (سلالة الخشب بدون بروتين أ) الجسيمات الحيوية ، غير المسمى تقنيات الحياة إس 2859 محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ تقنيات الحياة 15250-061 4.0 مل فكوتينر يحتوي على 7.2 مجم K2EDTA ، مجفف بالرش VWR BD367861 ستحتاج إلى 1 أنبوب جمع الدم K2 EDTA لكل عينة. 4.0 مل فراغ يحتوي على 68 وحدة USP ليثيوم هيبارين ، مطلي بالرش VWR BD367884 ستحتاج إلى 1 أنبوب ليثيوم هيبارين لجمع الدم لكل عينة. كولتر تيار متردد 5 ديف سي بي بيكمان كولتر 6605705 أي محلل أمراض الدم كولتر AC·T 5diff شطف بيكمان كولتر 8547167 كولتر AC·T 5diff فيكس بيكمان كولتر 8547171 كولتر تيار متردد 5 ديف دبليو بي سي ليز بيكمان كولتر 8547170 كولتر تيار متردد 5 ديف Hgb ليز بيكمان كولتر 8547168 معاير كولتر AC · T 5diff Cal بيكمان كولتر 7547175 كولتر تيار متردد 5 ديف كونترول بلس بيكمان كولتر 7547198 AcT 5diff المخفف بيكمان كولتر 8547169 200 ميكرولتر أطراف ماصة ممتدة الطول VWR 37001-526 مقلاة ثلج معزولة VWR 89198-980 لحمام الماء المثلج. رف أنبوب معدني مفتوح VWR 60916-702 مصل الأبقار الجنينية تقنيات الحياة هاتف 26140-111 محطة عمل TQ-Prep بيكمان كولتر 6605429 أي محطة عمل تحضير ليز الخلية الآلي نظام كاشف ImmunoPrep بيكمان كولتر 7546999 على سبيل المثال ، نظام كاشف إصلاح RBC / WBC كولتر كلينز بيكمان كولتر 8546929