القياس الكمي لمستويات الوسيط المناعي في سائل بطانة الغشاء المخاطي البشري

الملخص

المصدر: Wolsk ، H. M. et al. ، أخذ عينات غير جراحية من سائل البطانة المخاطية لتقدير مستويات الوسيط المناعي في الجسم الحي.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو القياس الكمي لمستويات الوسيط المناعي في مستخلص سائل بطانة الغشاء المخاطي للأنف البشري حديثي الولادة. يقيس نظام الفحص المتعدد القائم على التلألؤ الكهربائي هذه الوسطاء من خلال تقييم شدة الضوء المنبعث عندما يكونون متحمسين.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

1. الإعداد التجريبي

1. استخدم أوراق الترشيح (صفائح البوليستر الليفية المهيدروكسيلة ، انظر جدول المواد).
   1. قطع شرائط بحجم 3 × 15 مم لطفل يبلغ من العمر شهرا واحدا وعلى شكل حرف L للأطفال الأكبر سنا والبالغين (5 × 20 × 10 مم (ذراع قصير من L)).
2. أدخل قطعة واحدة من ورق الترشيح في كل فتحة أنف للرضيع باستخدام الملقط. ضع ورق الترشيح في الجزء الأمامي من المحارة السفلية (حوالي 1 سم داخل فتحة الأنف لحديثي الولادة و 1.5 سم لجميع الأعمار الأخرى).
   1. ضع الأطفال حديثي الولادة على السرير وامنحهم ماء السكر للراحة.
      ملاحظه: بالنسبة للأطفال من جميع الأعمار الأخرى ، يتم إجراء أخذ العينات بسهولة أكبر مع جلوس الموضوع على كرسي.
   2. بالنسبة للأطفال الأكبر سنا ، أدخل الذراع الطويلة لورق الترشيح على شكل حرف L في كل فتحة أنف.
3. ضع مشبك أنف حول فتحتي الأنف لتقليل الانزعاج وتجنب الفقد العرضي لورق الترشيح.
4. قم بإزالة أوراق الترشيح بعد 2 دقيقة من الامتصاص.
5. ضع أوراق الترشيح في أنابيب ملصقة وقم بتجميدها على الفور عند -80 درجة مئوية.
6. دون أي أعراض لعدوى مجرى الهواء أظهرها الطفل في يوم أخذ العينة.
7. سجل أي عطس أو بكاء مستمر أو رعاف يحدث خلال دقيقتين من أخذ العينات.

< p class = "jove_title" >2. القياس الكمي لوسطاء مناعة مجرى الهواء

1. خذ ما يصل إلى 10 عينات عشوائية من الفريزر. سجل أرقام التعريف. احتفظ بالعينات على الجليد أثناء عملية العمل بأكملها.
2. بعد الذوبان على الجليد ، اغمر أوراق الترشيح (لكل موضوع) من كلا فتحتي الأنف في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر حديثا (انظر جدول المواد) يحتوي على قرص واحد كامل لمثبطات البروتياز (انظر جدول المواد) لكل 25 مل من المخزن المؤقت.
   1. اضبط حجم المخزن المؤقت وفقا لحجم ورق التصفية.
      1. استخدم 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لورق الترشيح بحجم 3 × 15 مم.
      2. في حالة توفر ورق ترشيح واحد فقط، استخدم نصف حجم المخزن المؤقت (150 ميكرولتر).
3. انقل العينات إلى شاكر الألواح (400 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق.
4. انقل أوراق الترشيح الرطبة ومخزن الفحص المؤقت إلى كوب مرشح أنبوب أسيتات السليلوز (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) الموضوع داخل أنبوب الطرد المركزي الدقيق (انظر جدول المواد).
5. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد (عند 4 درجات مئوية) للحصول على مستخلص الأنف المفلتر في الأنبوب.
6. قم بإزالة الكوب واحتفظ بالأنابيب على الجليد أثناء نقل مستخلص الأنف في آبار ألواح التخزين منخفضة البروتين (انظر جدول المواد).
7. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التحليل.
8. تحديد تركيزات السيتوكينات والكيموكينات في مستخلصات الأنف باستخدام نظام مصفوفة متعدد الإرسال عالي الحساسية قائم على التلألؤ الكيميائي الكهربائي (انظر جدول المواد). < / > ج: تم إجراء فحص السيتوكين البشري 10-plex T_H1 / T_H2 ، ومقايسة الكيموكين 9-plex ، وإنترلوكين أحادي البلكس -17A (IL-17A) ، وتحويل عامل النمو beta1 (TGF-β1) ، والليمفاوية اللحمية الصعترية (TSLP) هنا.
   1. بالنسبة للمقايسات ، احتضان مستخلصات الأنف طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بإجراء القياسات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة القياسي (انظر جدول المواد).
      ملاحظه: عادة ما يكون للمقايسات المناعية (انظر جدول المواد) نطاق ديناميكي مرتفع للقياس يتراوح بين 1 و 10,000 بيكوغرام / مل ، ولكن بالنسبة لبعض الفحوصات ، يمكن أن يكون 100,000 بيكوغرام / مل. هذا يعني أنه يمكن تشغيل جميع العينات بنفس التخفيف ، مما يحد من تأثير التخفيفات غير المتشابهة في الأشخاص الأصحاء والمرضى، كما هو الحال في المقايسات المناعية المماثلة الأخرى. كان الحد الأدنى للكشف عن جميع السيتوكينات هو 1 بيكوغرام / مل أو أقل ، وبالنسبة للكيموكينات ، تراوح بين 1 و 50 بيكوغرام / مل. لم يكن TSLP قابلا للاكتشاف في 98٪ من العينات في عمر شهر واحد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات صفائح البوليستر الليفية المهيدروكسيلة أكيويك الترا SPR0730 ورق الترشيح Milliplex فحص المخزن المؤقت ميليبور L-AB مخزن مؤقت لوحات تخزين ملزمة منخفضة البروتين الترمو: العلمية CLS8161 لوحات مثبط الإنزيم البروتيني روش 11873580001 كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA قارئ لوحات متعددة البقع مقياس متوسط غير أ تصوير القطاع 6000 المقايسات مقياس متوسط مقايسة السيتوكين البشرية 10-plex TH1 / TH2 ومقايسة الكيموكين 9-plex ، و singleplex IL-17A و TGF-β1 و TSLP. يمكن العثور على وصف على الإنترنت على www.mesoscale.com