$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تصميم وتحضير الببتيدات
- الحصول على تسلسل بروتين الاندماج محل الاهتمام من قاعدة بيانات عامة مثل NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) أو قاعدة بيانات مسببات الأمراض الفيروسية (https://www.viprbrc.org). اختر موقع التعرف على البروتياز الذي يسبق ببتيد الاندماج وقم بتضمين 2-3 أحماض أمينية في المنبع واتجاه مجرى هذا التسلسل.
- عند طلب الببتيدات ، قم بتعديلها باستخدام زوج FRET 7-methoxycoumarin-4-yl acetyl (MCA) في الطرف N و N-2،4-dinitrophenyl (DNP) في الطرف C.
ملاحظه: يقدم العديد من الموردين هذه التعديلات. السعر ووقت التسليم يعتمدان على المورد المفضل. ومع ذلك ، توجد تعديلات بديلة تختلف في الحساسية وتتطلب تعديلات على قارئ اللوحة من حيث الأطوال الموجية.
- أعد تعليق الببتيد وفقا لتوصيات الشركة المصنعة عن طريق ماصته برفق لأعلى ولأسفل. على سبيل المثال ، قم بتعليق الببتيدات في 70٪ من الإيثانول إلى التركيز النهائي البالغ 1 ملليمتر.
- اختياريا ، أضف الأنبوب الذي يحتوي على الببتيد والمذيب في حمام صوتنة حتى يتم تعليقه بالكامل إذا لم يتم تعليق الببتيد جيدا عن طريق سحب العينات.
قم - بتقطيع الببتيد في أنابيب مخللة للضوء أو مقاومة لحماية الببتيد من التبييض. حافظ على أحجام الكميات الصغيرة لتجنب دورات التجميد / الذوبان المتعددة (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر). قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير قارئ اللوحة الفلورية
- قم بتشغيل قارئ اللوحة وانتظر حتى ينتهي الاختبار الذاتي.
- افتح برنامج التشغيل على الكمبيوتر المرفق وتأكد من توصيله بقارئ الألواح.
- افتح إعداد درجة الحرارة واضبطه على 30 درجة مئوية (أو درجة الحرارة المطلوبة للحصول على الأداء الأمثل للبروتياز).
- انقر فوق Control | إعداد الأداة لإعداد التجربة.
- اختر الحركية.
- حدد الفلورة.
- أدخل الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث: 330 نانومتر و 390 نانومتر على التوالي.
- قم بإلغاء تحديد Auto Cut-off.
- حدد متوسط، حساسية عادية.
- اختر وقت تشغيل مدته 1 ساعة للمقايسة وحدد قياسا واحدا كل 60 ثانية.
- اضبط الخلط 5 ثوان قبل القياس الأول و 3 ثوان قبل كل قياس
- حدد الآبار لقراءتها وبدء المقايسة.
3. تحضير الفحص
- قم بإعداد المخزن المؤقت للفحص عن طريق حساب الكميات المناسبة لكل مكون وإضافته. بالنسبة للفورين ، قم بعمل مخزن مؤقت يتكون من 100 ملي مولار HEPES ، و 1 ملي مولار CaCl2 ، و 1 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول ، و 5٪ تريتون X-100. بالنسبة للتربسين ، استخدم محلول ملحي قياسي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظه: أحجام 10 مل أو أقل كافية. اعتمادا على البروتياز (البروتياز) المستخدم في الفحص ، يختلف المخزن المؤقت.
- برد العازلة على الجليد.
- ضع لوحة الفحص على الجليد مع وجود صفيحة معدنية رفيعة تحتها لدعم التبريد والاستقرار. استخدم صفيحة بوليسترين سوداء صلبة سعة 96 بئرا ذات قاع مسطح وغير معالج><.
ملاحظه: من الضروري استخدام الألواح السوداء لمنع "تسرب" الفلورسنت من الآبار المجاورة.
- احسب الكمية المناسبة من البروتياز لإضافتها لكل تفاعل بناء على المنشورات السابقة أو البيانات التجريبية. بالنسبة للفورين ، استخدم وحدة واحدة لكل تفاعل يعادل 0.5 ميكرولتر. بالنسبة للتربسين ، استخدم 0.5 ميكرولتر من 160 نانومتر TPCK trypsin.
- لكل عينة قم بإعداد 3 مكررات تقنية لكل اختبار بحجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر لكل عينة.
ملاحظه: تم تقييم تجريبي أنه لا يحدث فرقا سواء تم إجراء سحب العينات في ظروف الإضاءة العادية أو الضوء الخافت. ومع ذلك ، لا ينبغي أن تتعرض الببتيدات للضوء لفترة طويلة من الزمن.
- ماصة الكمية المناسبة من المخزن المؤقت للفحص (94.5 ميكرولتر كما هو موضح في الخطوة 3.1) في كل بئر.
- أضف البروتياز إلى كل بئر. لكل من التربسين الفورين و TPCK ، استخدم 0.5 ميكرولتر لكل عينة. إلى 6 آبار (3 آبار للتحكم الفارغ و 3 آبار للتحكم في الببتيد) ، أضف 0.5 ميكرولتر عازلة بدلا من البروتياز المعني.
- أضف الببتيد إلى تركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر في كل بئر باستثناء عنصر التحكم الفارغ. في هذه الحالة ، تم تحضير ببتيد الماصة 5 ميكرولتر كما هو موضح في الخطوة 1.3. أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى عنصر التحكم الفارغ بدلا من الببتيد.
ملاحظه: تم اختبار عدة تركيزات من الببتيد في البداية باستخدام تركيزات الإنزيم الموصوفة للتأكد من أن الإنزيمات مشبعة.
- أدخل اللوحة في قارئ اللوحة الفلورية وانقر فوق ابدأ.